Coniugazione anticorpo con dynabeads

L’anticorpo di interesse e l’anticorpo del controllo negativo, sono coniugati alle biglie magnetiche(Dynabeads):

Anticorpo d’analisi: anti-fosfo-ɤH2AX (Millipore) si lega agli istoni fosforilati in seguito alla risposta cellulare al danno al DNA indotto dal farmaco.

Anticorpo controllo negativo: Rabbit IgG è un anticorpo (fornito dal kit) che permette di misurare il legame non specifico.

 Le Dynabeads sono state delicatamente risospese evitando che si formino bolle di aria.

 Aggiungere 100µL di eluition buffer in ogni tubo.

 Aggiungere 10µL di Dynabeads Protein A/G in ogni tubo e sospeso delicatamente il materiale.

 I tubi vengono posti nel DynaMag-PCR Magnet ed atteso il tempo necessario (almeno 30s) affinché le beads formino un pellet ben adeso sul fondo.

 Rimuovere il sovranatante.

 Successivamente i tubi sono rimossi dal magnete e sono aggiunti 100µL di Eluition buffer in ogni tubo.

 Aggiungere 1µL di anticorpo di controllo (1µg/µL) negativo nell’apposito tubo di controllo.

 Il materiale in ogni tubo è stato gentilmente risospeso e messo in agitazione per 1 ora a 4°C.

2.3.2.1. Preparazione delle cellule

2.3.2.1.1Cross link delle cellule in sospensione.

 Terminata l’incubazione del trattamento col farmaco, il materiale viene portato a un volume di 500µL per gli step successivi, aggiungendo la quantità mancante di PBS se il volume fosse inferiore o effettuando una centrifuga e risospendendo in 500µL di PBS il pellet se il volume fosse superiore.

 Aggiungere 13.5µL di formaldeide al 37% (Sigma Aldrich) in ogni tubo così da raggiungere una concentrazione finale del 1%. Il materiale è stato risospeso e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente.

 Aggiungere 57µL di Glicina 1.25M, (fornita dal kit), precedentemente posta a temperatura ambiente, in ogni tubo. e risospeso il materiale e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente per terminare la reazione di crosslink DNA proteina.

 Il materiale viene centrifugato a 4°C a 200rcf per 10 minuti. Gli step successivi sono effettuati mantenendo i tubi in ghiaccio.

 Aspirare il sovranatante lasciando circa 30µL attorno al pellet.

 Le cellule sono delicatamente risospese in 500µL di PBS mantenuto in ghiaccio e centrifugate a 200rcf per 10 minuti a 4°C.

 Aspirare il sovranatante e aggiungere 500µL di PBS mantenuto precedentemente in ghiaccio. Centrifugare a 200rcf per 10 minuti a 4°C.

 Aspirare il sovranatante lasciando circa 10/20µL attorno al pellet. 2.3.2.2. Praparazione Lysis buffer

Sono preparati 100µL di Lysis Buffer (fornito dal kit) contenente inibitori di proteasi che prevengono la degradazione delle proteine.

 Aggiungere a 99.5µL di Lysis buffer, 0.5µL di inibitori di proteasi 200X (forniti dal kit) in modo tale da raggiungere una concentrazione 1X.

 Aggiungere 50µL di Lysis Buffer al pellet cellulare.  Il materiale è risospeso e vortexato.

 Incubare in ghiaccio per 5 minuti.

 Se il materiale non viene subito impiegato è conservato a -80°C. 2.3.2.3 Sonicazione

La sonicazione è una tecnica che consiste nel sottoporre all’azione degli ultrasuoni sia sospensioni cellulari, per provocare la rottura delle membrane biologiche e recuperare il contenuto intracellulare, sia proteine o DNA, per ottenerne frammenti di massa molecolare uniforme.In laboratorio la sonicazione è normalmente condotta con l'ausilio di un sonicatore, un apparecchio che genera vibrazioni meccaniche amplificate sfruttando corrente elettrica ad elevata frequenza prodotta da un generatore. Gli ultrasuoni vengono trasmessi in una vasca contenente acqua, che può essere anche termostatata a varie temperature. La cavitazione sonica è l'effetto energetico che viene fondamentalmente sfruttato.

La cromatina dovrebbe essere ridotta in frammenti di 200-500bp per l’analisi finale mediante qPCR. È stato utilizzato per questa procedura il sonicatore Bioruptor Pico (Fig. 16) come consigliato dal kit.

 Risospendere delicatamente il materiale.

 Il sonicatore viene settato così da sonicare il lisato cellulare attraverso 26 cicli di cui 13 effettuati 30s ON e 30s OFF e i restanti 13 effettuati 30s ON e 60s OFF a 4°C.  Centrifugare a 20000rcf a 4°C per 5 minuti. Trasferire il sovranatante, che conterrà

la cromatina in un nuovo tubo sterile.

 Per controllo delle dimensioni dei frammenti ottenuti, un’aliquota del materiale sonicato viene sottoposto a corsa elettroforetica su gel d’agarosio al 2% con ladder di 100bp come segue:

- Sono stati prelevati 5µL di campione sonicato a cui sono stati aggiunti 0.5µL di proteinasi K e incubato a 55°C per 20 minuti.

- Il materiale è sottoposto a centrifuga a 20000rcf a 4°C per 5 minuti.

- Il materiale viene sottoposto a corsa elettroforetica su gel d’agarosio al 2%. Per la preparazione del gel di agarosio sono stati usati i seguenti reagenti: - TBE (tris-borato-EDTA) 1X

- Agarosio - Etidio Bromuro

I campioni vengono corsi su gel assieme a un ladder di peso molecolare noto che permette di identificare la lunghezza del prodotto di PCR. Il gel viene osservato mediante transilluminatore ad UV.

È stato ottenuto uno smear sul gel fra 200bp e 500bp compatibilmente con le aspettative.

Fig. 16 - Bioruptor Pico, utilizzato per la sonicazione.

 Per il controllo della quantità di DNA un’aliquota di cromatina viene quantificata prima di procedere con gli step successivi mediante NanoDrop™ Lite Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).

Il nanodrop è uno spettrofotometro che permette di misurare la concentrazione di acido nucleico a 260 nm e la sua purezza utilizzando il rapporto 260nm/280nm.

Questo sistema consente di depositare un’aliquota del campione (1µL/2µL) direttamente sulla superficie di misurazione ottica per effettuare la quantizzazione.

2.3.2.4 Diluizione della cromatina

La cromatina sottoposta a sonicazione viene diluita in base al numero di cellule con cui viene effettuata l’immunoprecipitazione.

Preparazione del Dilution Buffer come segue:

 Aggiungere gli inibitori di proteasi al Diluition Buffer in modo da raggiungere una concentrazione finale 1X. Il volume finale è 100µL per ogni reazione di

immunoprecipitazione. Viene inoltre preparata una diluizione extra per ogni campione di controllo che sarà utilizzato negli step successivi, ovvero l’input control.

L’input control è DNA ottenuto dalla cromatina che ha subito reverse crosslink, che non sarà’ immunoprecipitato con gli anticorpi ma servirà per analisi finale in qPCR.