Cromatografia su strato sottile (TLC)

La cromatografia su strato sottile (TLC) è una tecnica di cromatografia liquida piana di ripartizione solido-liquido semplice e veloce, che permette l'analisi di più campioni contemporaneamente, può essere impiegata sia a scopi analitici sia preparativi.

La fase stazionaria è immobilizzata sotto forma di strato sottile, su una superficie, lungo la quale viene fatta correre la fase mobile (per capillarità, per gravità oppure esercitando una certa pressione). Più precisamente la fase stazionaria è costituita da un materiale granulare omogeneo fatto aderire a un supporto piano o più raramente (cilindrico); l‘insieme della fase stazionaria e del supporto è detto lastrina.

Se la fase stazionaria è un materiale polare (come il gel di silice), la separazione di miscele è dovuta principalmente a meccanismi di adsorbimento e perciò la fase mobile non deve essere polare; in questo caso si parla di cromatografia normale (o in fase diretta). Se invece lo strato è modificato (o imbevuto) con sostanze non polari, la separazione è dovuta principalmente a meccanismi di ripartizione per cui la fase mobile deve essere polare; in questo caso si parla di cromatografia a fase inversa. Attualmente si possono preparare strati di vario tipo, che permettono di sfruttare, per la separazione, anche fenomeni di scambio ionico e di esclusione.

Secondo la procedura più diffusa, il campione è depositato sulla lastrina mediante un capillare che permette di porre una piccola quantità sotto forma di macchia a circa un centimetro dalla base, sopra il livello raggiunto dal solvente nella camera di sviluppo. Successivamente la lastrina viene posta in verticale nella camera facendo in modo che peschi nel solvente. Man mano che il solvente risale lungo la lastrina si ha la ripartizione del campione in base alla diversa affinità fra la fase stazionaria e quella mobile. La velocità di risalita del solvente è determinata dalla sua polarità.

Dalla polarità, dipende l‘entità del trascinamento delle sostanze lungo la lastrina in una TLC normale. È possibile ordinare i solventi puri e anche le miscele di solventi in una serie eluotropa, secondo la polarità crescente (Tabella 6.2). In generale più una molecola è polare, maggiore è la sua capacità di eluire altre molecole.

Tabella 6.2 - Serie Eluotropa di miscele di solventi adatti per TLC.

L‘analisi viene interrotta quando l‘eluente raggiunge la sommità della lastrina che viene quindi tolta dalla camera di sviluppo. Prima che l‘eluente si asciughi è bene segnare a matita la linea del fronte del solvente.

Si può controllare lo sviluppo con luce ultravioletta se il composto è UV visibile. L'esame della lastra sotto UV mostrerà la posizione delle macchie di sostanze che assorbono nell'ultravioletto o la posizione delle macchie di composti fluorescenti.

E' possibile confrontare fra loro le sostanze, presenti nella lastrina, attraverso i loro RF (Fattori di Ritenzione) cioè in base al rapporto tra la distanza percorsa dalla sostanza e la distanza percorsa dal solvente.

La tecnica TLC può essere usata come metodo separativo, in questo caso il supporto rigido è in vetro in modo da permettere l‘asportazione delle macchie tramite raschiamento. Il campione viene applicato sotto forma di striscia continua sulla lastra preparativa e il controllo (che può essere uno standard) viene applicato sotto forma di goccia con capillare in una porzione ristretta a lato del campione. Dopo lo sviluppo della lastra, le bande vengono visualizzate attraverso luce ultravioletta e differenziate con un tratto di matita. La banda d‘interesse viene asportata tramite raschiamento e

6. TECNICHE ANALITICHE UTILIZZATE NELLA CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE LIPIDICA DELLA CARNE 100 posta in una colonna di piccole dimensioni dove un solvente opportuno scioglie e asporta dal materiale della fase stazionaria il composto d‘interesse.

Questa tecnica cromatografica presenta numerosi vantaggi poiché consente la separazione delle sostanze con rapidità e permettere l‘analisi contemporanea di più campioni, usandone una quantità molto piccola. Il processo di separazione è facile da seguire e la velocità con la quale si possono ottenere i cromatogrammi rendono la cromatografia su strato sottile un mezzo utile per indagini preliminari e di routine.

La cromatografia su strato sottile può essere un metodo analitico qualitativo basato sulla valutazione dei valori degli RF delle macchie. Il maggior inconveniente è costituito dal fatto che gli RF per le diverse sostanze non sono spesso riproducibili in modo esatto, ciò è dovuto ad una serie di fattori sperimentali che devono essere perfettamente controllati come la natura dell‘adsorbente e lo spessore dello strato.

L‘uso di adsorbenti commerciali standard superiori a 0,15 mm e soprattutto un controllo rigoroso del tempo di essiccamento, e quindi dei tenori di umidità, sono in grado di ridurre al minimo le eventuali variazioni, inoltre l‘eluente deve essere sempre del medesimo grado di purezza.

Bisogna considerare che, mentre la natura delle sostanze da analizzare sfugge evidentemente ad ogni controllo, la loro quantità non comporta alcun effetto, basta che non si superi la capacità del sistema.

Occorre anche ricordare che per una certa sostanza il valore dell‘RF può essere leggermente diverso a seconda che sia stato determinato analizzando la sostanza pura o in miscela.

Un altro fattore importante è la saturazione della camera prima dell‘inizio dello sviluppo della lastra cromatografica. Si può ottenere facilmente un buon grado di saturazione collegando, con strisce di carta da filtro, il solvente, presente sul fondo della camera, con le pareti e le sommità della camera. Una completa saturazione rende più rapido lo sviluppo della lastrina e permette di ottenere valori degli RF più costanti, inoltre il fronte del solvente e le macchie appariranno meglio definite.

La TLC è una delle tecniche più usate per la separazione delle classi lipidiche. Sebbene per questa applicazione possano essere utilizzate diversi tipi di lastre, quelle maggiormente impiegate sono quelle in gel di silice G (contenenti solfato di calcio come legante). Un esempio di sistemi di solvente utilizzati per la separazione delle differenti classi lipidiche è riportato in Tabella 6.3.

Tabella 6.3 Solventi utilizzati per la separazione nelle differenti classi lipidiche.

Lastre Solvente Rapporto Separazione di

1 G Esano/dietil etere/acido acetico 85:15:1 CE, FAME, TAG, FFA, Ch 2 G Esano/dietil etere/acido acetico 70:30:1 MAG, (DAG più Ch), FFA, TAG 3 G 1,2 dicloroetano 100 FAME da dimetilacetali 4 G, BA Benzene 100 Sn 2-MAG da sn 1e sn 3-MAG; sn

1,3-DAG da sn 1,2- e sn 2,3 -DAG 5 G; Ag+ Esano/dietiletere 90:10 FAME di monoeni cis e trans,

saturi

6 G; Ag+ Esano/dietiletere 70:30 FAME di triinsaturi cis e trans 7 H Cloroformio/metanolo/acqua 65:25:4 DGP, PE (PS più PI) PC, SPH 8 H 1: cloroformio/metanolo/idrossido

d‘ammonio

2: cloroformio/acetone/metanolo/acido acetico/acqua

3: esano/dietil etere/ acido acetico

65:25:4 50:20:10:15:5

85:15:1

PC, PE, PS, PI, DPG, PA, SPH, LPC, CER, FFA Ch, TAG, FAME, CE

Abbreviazioni: BA- acido borico; Ag+- ioni d‘argento; G-lastra in gel di silice G; H-lastre in gel di silice H; CE- esteri del colesterolo; FAME-metil esteri degli acidi grassi; TAG-triacilglicerolo; Ch-colesterolo; MAG- monoacilglicerolo; DAG- diacilglicerolo; FFA- acidi grassi liberi; PE-fosfatidiletanolammina; DGP- difosfatidilglicerolo (cardiolipina); PS- fosfatidilserina; PI- fosfatidilinositolo; SPH- sfingomielina; PA- acido fosfatidico; PC- fosfatidilcolina; LPC-lisofosfatidilcolina; CER-cerebrosidi.

6. TECNICHE ANALITICHE UTILIZZATE NELLA CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE LIPIDICA DELLA CARNE 102

Generalmente la fase mobile è costituita da una miscela trifasica formata da esano/dietil etere/acido acetico (85:15:1; v/v/v). Un esempio di separazione delle varie classi lipidiche nelle condizioni suddette è mostrato in Figura 6.1.

Figura 6.1 - Separazione delle classi lipidiche su lastre in gel di silice G.

Gli esteri del colesterolo migrano verso il fronte del solvente, seguiti dai trigliceridi, dagli acidi grassi liberi, dal colesterolo, dai digliceridi, dai monogliceridi ed infine dai fosfolipidi (con gli altri lipidi polari).

Le bande sono evidenziate mediante una soluzione di 2‘,7‘- diclorofluorescina e osservate alla luce ultravioletta.

Le lastre in gel di silice G così come quelle con rivestimento in allumina possono essere usate anche per la separazione in classi della frazione polare dei fosfolipidi. E‘ possibile modificare chimicamente queste lastre rivestendole per esempio, con silicato od ossalato di magnesio in modo tale da migliorare la separazione di tutte le classi di fosfolipidi. L‘aggiunta di acido etilendiammino tetra acetico o solfato di ammonio migliora la risoluzione dei fosfolipidi acidi (fosfatidilserina, (PS), fosfatidilinositolo ( PI)). Anche l‘acido borico e il nitrato d‘argento aggiunti possono dare una risoluzione migliore.

Esteri del colesterolo triacilgliceroli

Acidi grassi liberi

1,2 diacilgliceroli 1,3 –diacilgliceroli

fosfolipidi

Fronte del solvente Esteri del colesterolo

triacilgliceroli

Acidi grassi liberi

1,2 diacilgliceroli 1,3 –diacilgliceroli

fosfolipidi Esteri del colesterolo

triacilgliceroli

Acidi grassi liberi

1,2 diacilgliceroli 1,3 –diacilgliceroli

fosfolipidi

La fase mobile è generalmente costituita da cloroformio/metanolo/acqua (25:10:1; v/v/v). La separazione avviene come mostrato in Figura 6.2.

Figura 6.2 - Separazione della frazione polare dei fosfolipidi su lastre in gel di silice G.

I lipidi meno acidi come il difosfatidilglicerolo, migrano prima rispetto ai fosfolipidi contenenti fosfatidilcolina e fosfatidiletanolammina, la fosfatidilserina tende a eluire con la fosfatidiletanolammina mentre il fosfatidilinositolo co-eluisce con la fosfatidilcolina.

In alcuni casi è preferibile usare lastre di silice H (senza legante), per ottenere separazioni più nitide, poiché permettono di separare la fosfatidilserina dal fosfatidilinositolo.

Tuttavia queste lastre risultano essere molto più fragili rispetto a quelle G.

Un sistema di separazione di questo tipo, utilizzato specialmente per i lipidi di tessuti di origine animale, è costituito da uno strato di gel di silice H, preparato con una soluzione di carbonato di sodio 1mM per rendere la fase stazionaria leggermente basica, e sviluppato in cloroformio/metanolo/acido acetico/acqua (25:15.4.2 v/v/v/v, Figura 6.3).

Il difosfatidilglicerolo e l‘acido fosfatidico si spostano verso il fronte del solvente, mentre la fosfatidilserina ed il fosfatidilinositolo migrano tra i costituenti fosfolipidici più abbondanti. Se nel campione sono presenti lipidi semplici, questi possono essere posizionati sulla parte alta della lastra mediante eluizione con acetone/esano (1:3 v/v) prima della separazione dei fosfolipidi.

Fronte del solvente difosfatidilglicerolo

fosfatidiletanolammina

fosfatidilcolina sfingomielina lisofosfatidilcolina

Fronte del solvente difosfatidilglicerolo

fosfatidiletanolammina

fosfatidilcolina sfingomielina lisofosfatidilcolina

6. TECNICHE ANALITICHE UTILIZZATE NELLA CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE LIPIDICA DELLA CARNE 104

Figura 6.3 - Separazione della frazione polare dei fosfolipidi su lastre in gel di silice H.