Determinazione degli Acidi Linoleici Coniugati (CLA)

La determinazione degli isomeri degli acidi linoleici coniugati (CLA) e dei C18:l (cis/trans) può essere effettuata sia mediante analisi gascromatografica sia mediante cromatografia HPLC. Negli alimenti sono stati individuati 20 isomeri CLA differenti (Sehat et al. 1998). L'utilizzo della gascromatografia con le migliori colonne capillari attualmente disponibili non consente di ottenere una sufficiente risoluzione per separarli ed identificarli tutti. Questo è invece possibile mediante l‘impiego di tecniche HPLC con colonne a ioni d'argento.

6.4.1 Identificazione degli isomeri coniugati dell’Acido Linoleico Coniugato (CLA) mediante gascromatografia (GC)

I primi passi per la separazione degli isomeri del CLA furono fatti negli anni ‘60, con l‘introduzione della TLC a ioni di argento (Thin Layer Chromatography). Il vero salto in avanti fu, però, fatto solo con l‘utilizzo della gascromatografia con colonne capillari, data la bassa concentrazione di queste sostanze, nelle matrici naturali (0.1%-2 %). Attualmente le colonne migliori sono quelle apolari che hanno almeno una lunghezza di 100 m. La gascromatografia, però, non è completamente risolutiva. Esistono, infatti, problemi di coeluizione anche con le colonne lunghe 100m. E‘ possibile che alcuni isomeri del CLA coeluiscano con altri acidi grassi che si ritrovano naturalmente nelle matrici lipidiche di origine animale come il C21:0 (figura 6.8).

Fra i vari isomeri del CLA quelli che presentano il primo doppio legame con geometria cis sul carbonio a numero più basso, eluiscono a tempi minori rispetto a quelli che lo recano su di un carbonio a numerazione più alta. A parità di posizione del legame cis, fluisce a tempi più bassi, l‘isomero con il legame trans sul carbonio a più bassa numerazione. Come conseguenza si ha che gli isomeri del tipo cis, trans escono prima di quelli trans, cis. Un altro aspetto importante è legato al fatto che il secondo isomero più rappresentato nel latte e nella carne dei ruminanti, dopo il 9c, 11t, è il 7t, 9c che coeluisce con il 9c, 11t anche usando colonne capillari da 100 m, ma può essere separato in HPLC utilizzando tre colonne in serie a ioni. L‘identificazione dei differenti isomeri del CLA tramite gascromatografia può essere fatta accoppiando tale tecnica ad uno spettrofotometro FTR o ad uno spettrometro di massa.

Nel primo caso si sfruttano le differenze nel numero di bande e nella loro esposizione in due regioni dello spettro 2800-3000 e 980-950 cm-1, nel secondo caso si sfrutta la differente frammentazione degli addotti di Diels Alder dei dieni coniugati con il 4-metil-l,2,4-triazolin-3,5- dione (MTAD) o con il 2-alchenil-4,4-dimetilossazolina (DMOX).

Spesso la quantificazione per via gascromatografica viene effettuata utilizzando delle curve di calibrazione con standard interno, quello più utilizzato è il MeC19:0, metilestere del C19:0.

Figura 6.8 - Separazione degli isomeri di CLA in gascromatografia utilizzando una colonna apolare da 100 m.

Il cromatogramma A mostra il profilo di una miscela standard di CLA addizionata con C21:0, il cromatogramma B mostra un campione di latte dove il C21:0 è naturalmente presente, il cromatogramma C mostra un campione di latte prodotto da vacche alimentate con farina di pesce, mentre il cromatogramma D mostra il formaggio prodotto dal latte di vacche al pascolo, da Kramer et al., (2004).

6. TECNICHE ANALITICHE UTILIZZATE NELLA CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE LIPIDICA DELLA CARNE 120 6.4.2 Identificazione degli isomeri dell’Acido Linoleico Coniugato (CLA) mediante

cromatografia liquida (HPLC)

L‘identificazione degli isomeri dell‘acido linoleico coniugato realizzata mediante HPLC con colonna a ioni d‘argento è attualmente il miglior metodo a disposizione per separare ed isolare gli isomeri geometrici e posizionali dell‘acido linoleico coniugato (CLA).

Si utilizzano colonne impaccate con particelle del diametro di 5-10μm con gruppi di acido fenilsolfonico legati ad un substrato di silice o con substrati simili che prevedano lo scambio dei protoni dell'acido solfonico con gli ioni d'argento. La separazione degli isomeri del CLA può essere realizzata secondo tre approcci differenti:

 Come esteri metilici,

 Come p-metossifenacilesteri,  Come acidi grassi liberi.

Il più utilizzato è il primo che prevede l‘uso di una fase mobile costituita da esano e piccole quantità di acetonitrile (0.1%) in fase mobile isocratica ad un flusso di l ml/min e una rivelazione al detector UV a 233 nm, (Kramer et al. 1999). Buoni risultati in termine di separazione sono stati ottenuti anche con una fase mobile costituita da esano/etere dietilico/acetonitrile in proporzione 99.4/0.5/0.1 (Kramer et al. 2004). Per ottimizzare la separazione dei singoli isomeri è necessario collegare in serie più colonne. Anche se in letteratura si ritrovano casi in cui sono state utilizzate fino a sei colonne contemporaneamente, per la maggior parte degli scopi è sufficiente utilizzare tre colonne. La sequenza d‘eluizione prevede che compaiano prima gli isomeri trans, trans, poi i cis,

Tabella 6.4 - Ordine di eluizione degli isomeri metilesteri geometrici e posizionali del CLA con colonna a ioni d‘argento in HPLC (Ag+-HPLC)a (da Kramer et al., 1999).

trans,trans-18:2b cis,trans-18:2b,c cis,cis-18:2b

(13t,15t)d (13,15 c/t) (13c,15c) 12t,14t 12,14 c/t 12c,14c 11t,13t 11t,13c 11c,13c 10t,12t 11c,13t 10c,12c 9t,11t 10,12c/t 9c,11c 8t,10t 9c,11t 8c,10c 7t,9t 9t,11c 7c,9c (6t,8t) 8,10c/t 7t,9c

a _{L‘eluizione della classe prevede : tutti gli isomeri posizionali (CLA) trans,trans,}

seguiti da tutti i cis/trans, seguiti a loro volta da tutti i cis/cis.

b _{L‘eluizione osservata di ogni classe di isomeri geometrici CLA aumenta al}

diminuire del valore di Δ.

c _{Per lo stesso isomero posizionale, l‘isomero geometrico cis,trans ed il relativo} trans,cis è stato analizzato per coppie dispari di valori di Δ, e non per Δ dispari.

L‘ordine di eluizione dell‘11,13-18:2 si è dimostrato opposto comparato con quello dell‘isomero geometrico 9,11-18:2. L‘ordine di eluizione del 7,9-18:2 non è stato determinato.

d

Gli isomeri CLA mostrati in parentesi non sono stati confermati.

Le problematiche più comuni legate a questo tipo di separazioni risiedono nella difficoltà di raggiungere tempi di ritenzioni complessivi riproducibili. Questo problema deriva principalmente dalla temperatura e dalla precisione con la quale è possibile preparare la fase mobile, che è costituita in questo caso da solventi assai volatili e solo in minima parte reciprocamente miscibili. In più la maggior parte dei sistemi cromatografici muniti di pompa multisolvente riescono a miscelare i vari solventi con una precisione massima dell‘ 1% per componente, per cui non è possibile automatizzare la composizione della fase mobile in linea. L‘impiego di solventi preparati di fresco ad ogni sessione analitica unitamente alla costante agitazione della fase mobile riducono questi effetti senza tuttavia annullarli

Per far fronte al problema dello scostamento dei volumi di ritenzione tra un‘analisi e l‘altra, può essere utilizzato il toluene come picco di riferimento, il cui volume di ritenzione viene utilizzato per calcolare quello relativo di ogni isomero di CLA (Delmonte et al., 2005).

Poiché non è attualmente disponibile uno standard interno per i CLA, cioè uno standard con doppi legami coniugati non presente nella matrice, la determinazione quantitativa può essere

6. TECNICHE ANALITICHE UTILIZZATE NELLA CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE LIPIDICA DELLA CARNE 122 realizzata o con il metodo dell'aggiunta, utilizzando standard commerciali dei singoli isomeri, oppure mediante la realizzazione di curve di calibrazione con il metodo dello standard esterno.