Dantrolene Ryanodin

25 μm

Figura 3.25 Cellule HN9 nelle

quali è stata impedita la fuoriuscita di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico trattandole per 5 ore con Ryanodina 10 μM e Dantrolene 20 μM. Il grafico mostra la quantificazione del segnale MagFluo di cellule così trattate

Dantrolene

Ryanodin 10 μM

Dantrolene

Ryanodin 10 μM

Figura 3.26 Cellule HN9

trattate per 5 ore con Ryanodina 10 μM e Dantrolene 20 μM. nelle quali l’aumento di Ca2+ del reticolo induce sprouting neuritico. Il grafico mostra la

quantificazione del differenziamento usando la

classificazione di Futerman.

Le cellule indifferenziate passano dall’88,5 % ± 2,93 del controllo al 35,8 % ± 4,2 del trattato per 5 ore con Dantrolene 20 mM ed al 41,08 % ± 4,33 nel trattato con Ryanodina 10 μM

0 20 40 60 80 100 10%FBS 5h Dantro 5h Ryan Stage1 Stage2 Stage3

***

***

Nella maggior parte degli esperimenti sono stati utilizzati gli indicatori AM i quali hanno un’estrema versatilità e sono facili da utilizzare ma hanno anche diversi problemi:

1. l’utilizzo del Mag-Fluo 4 come indicatore di calcio nel RE solo perché ha una bassa affinità per il Ca2+ e quindi lo lega solamente nei comparti nei quali lo ione è presente in alte concentrazioni non è esattamente corretta e potrebbe dar luogo ad artefatti e cattive interpretazioni dei risultati. Esistono infatti una serie di comparti cellulari come gli endosomi e i lisosomi nei quali il Ca2+ può raggiungere ad alte concentrazioni; anche i mitocondri, in condizioni fisiologiche particolari, possono accumulare grosse quantità di Ca2+ rilevabili dal Mag-Fluo-4 rendendo il segnale tutt’altro che specifico per il reticolo endoplasmatico. Lo stesso problema si può verificare con il Rhod-2 del quale sono ben note diverse localizzazioni extramitocondriali.

2. Poiché questi composti vengono intrappolati nelle cellule e così resi capaci di legare il Ca2+ ad opera delle esterasi intracellulari, l’aumento della fluorescenza di un indicatore AM potrebbe essere dovuta anche all’aumento dell’attività esterasica intracellulare e non ad un aumento reale del Ca2+

3. Questi composti sono disegnati sulla base dell’EDTA, EGTA o del BAPTA, e sono chelanti del Ca2+: ne possono quindi alterare le dinamiche intracellulari.

Per tutti questi motivi abbiamo verificato i nostri risultati utilizzando dei probes Ca2+ bioingegnerizzati (cfr materiali e metodi) che non presentano questi inconvenienti e che hanno un target per ognuno dei comparti cellulari da noi presi in esame.

Gli esperimenti hanno mostrato che mentre in cellule non stimolate i livelli di Ca2+ nel citoplasma, nel reticolo e nei mitocondri rimangono pressocchè costanti, in cellule trattate in modo tale da aumentare la ceramide intracellulare (o tramite la somministrazione esogena o con l’inibizione della ceramidasi ad opera della NOE) abbiamo osservato consistenti variazioni nell’omeostasi del Ca2+ intracellulare.

In particolare gli esperimenti hanno mostrato innanzitutto che nella nostra linea cellulare, non tutte le cellule rispondono simultaneamente allo stimolo indotto dalla ceramide: alcune lo fanno prima altre dopo; inoltre che la nostra idea di un aumento o di una diminuzione netta del calcio risulta una semplificazione di ciò che realmente avviene all’omeostasi del Ca2+ in una cellula stimolata.

Utilizzando la CytD1CPV (la cameleon citoplasmatica) abbiamo osservato che sia la somministrazione esogena di C2Cer sia il trattamento con la NOE inducono nelle HN9.10e un progressivo aumento del Ca2+ citoplasmatico: la C2Cer più velocemente della NOE e con un aumento del Ca2+ più marcato di quello osservato con l’inibitore della ceramidasi; in particolare già dopo 95 minuti con C2Cer 500 nM è possibile osservare un aumento del Ca2+ citoplasmatico che in alcune cellule arriva ad aumentare del 25% rispetto al tempo zero mentre con la NOE dopo 95 minuti si osserva un segnale tra il 10% ed il 15% maggiore di quello misurato all’inizio dell’esperimento.

Non stimolate 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Time (min) Fl uor e s c e nc e B a c k g roun d s ubt ra ct ed Cellula 1 Cellula 2 Figura 3,27

Cellule trasfettate con la CytD1CPV (la cameleon citoplasmatica) acquisite in time lapse in assenza di stimolazione. Il grafico mostra come il Ca2+ citoplasmatico rimanga pressocchè costante.

C2Cer 500 nM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 Time (min) Fl uor escence Back groun d s ubtracted Figura 3,28

Cellule trasfettate con la CytD1CPV e perfuse in time lapse con C2Cer 500 nM. La sequenza è durata 95 minuti ed il grafico mostra come la C2Cer induca un graduale aumento del Ca2+ citoplasmatico

Figura 3,29

Cellule trasfettate con la CytD1CPV e perfuse in time lapse con NOE 5 μM. La sequenza è durata 95 minuti ed il grafico mostra come anche l’aumento intracellulare di ceramide dovuto al blocco della ceramidasi, induca un graduale aumento del Ca2+ citoplasmatico 0 Cellula 1 Cellula 2 Cellula 3 Cellula 4 Cellula 5 Cellula 6 Cellula 7 NOE 5 μM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Time (min) fl u o resc en ce Ba ckg ro u n d Su btr

acted Cellula 1_{Cellula 2}

Cellula 3 Cellula 4 Cellula 5 Cellula 6 Cellula 7 Cellula 8 Cellula 9

Gli esperimenti svolti utilizzando la sonda con il target al reticolo endoplasmatico mostrano che le cellule trattate con C2Cer mostrano che la sostanza induce nelle cellule un netto aumento del contenuto di Ca2+ nel reticolo, ma, mentre gli aumenti citoplasmatici risultano essere abbastanza lineari, le variazioni del Ca2+ indotte dalla C2Cer nel reticolo hanno un aspetto oscillatorio. Poiché gli aumenti risultano essere molto rapidi, abbiamo monitorato anche cosa succede nei primi 35 minuti di trattamento aumentando la frequenza di acquisizione ( 1 frame ogni 30 secondi). Anche questi esperimenti hanno confermato che gli aumenti del calcio indotti dalla ceramide nel reticolo endoplasmatico sono assai rapidi.

ER non stimolato 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Time (min) fl uor e s c e nc e Ba c k ground S u b tra ct ed Cellula 1 Cellula 2 Cellula 3 Figura 3,30

Cellule trasfettate con la ERD1CPV (la cameleon del reticolo endoplasmatico) acquisite in time lapse in assenza di stimolazione. Il grafico mostra come il Ca2+ nel reticolo vada incontro a leggere fluttuazioni

Figura 3,32

Cellule trasfettate con la ERD1CPV e perfuse in time lapse con C2Cer 500 nM. La sequenza è durata un totale di 95 minuti

Il grafico mostra come non tutte le cellule rispondano nello stesso modo alla C2Cer che induce un forte e rapido aumento del Ca2+ nel reticolo endoplasmatico e come questo aumento abbia una natura “oscillatoria”

C2Cer 500 nM 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Time (min) Fl uor e s c e nce Ba ck gr ound s ubtr a c te d Cellula 1 Cellula 2 Cellula 3 Cellula 4 Cellula 5 Cellula 6 Cellula 7 Cellula 8 Cellula 9 Cellula 10 Cellula 11 Cellula 12 . C2Cer 500 nM 35' 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Time (min) Fl uor es ce nce B ac kgr ound subtr a cte d Cellula 1 Cellula 2 Cellula 3 Cellula 4 Cellula 5 Cellula 6 Figura 3,33

Cellule trasfettate con la ERD1CPV , perfuse con C2Cer in time lapse e seguite per 35 minuti con una frequenza di acquisizione maggiore. Anche in questo esperimento l’aumento di Ca2+ nel reticolo è stato rapido e tende ad aumentare nel tempo

NOE 5 μM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Time (min) Fluo re sc enc e B a ck gro und s ubtr ac te d Serie1 Serie3 Serie4 Serie5 Serie6 Serie7 Serie8 Serie10 Figura 3,34

Cellule trasfettate con la ERD1CPV e perfuse in time lapse con Noe 5 μM. La sequenza è durata un totale di 95 minuti

Anche l’aumento

intracellulare di Ceramide dovuto al blocco della ceramidasi induce aumento di Ca2+ nel reticolo, sebbene ad essere interessate da questo aumento siano il 60% delle cellule

Anche l’utilizzo di queste sonde altamente specifiche ha evidenziato che almeno nelle prime fasi del trattamento non c’è variazione significativa del Ca2+ mitocondriale.

Dopo aver raccolto numerose indicazioni che la C2Cer 500 nM induce aumento del Ca2+ libero nel RE, abbiamo effettuato una serie di esperimenti con l’equorinometro, per valutare di quale entità fosse questo aumento.

Abbiamo effettuato questi esperimenti trasfettando le cellule con l’equorina citoplasmatica e bloccando la SERCA con l’acido ciclopiazonico in un mezzo a zero Ca2+; per cui l’aumento della fluorescenza dell’equorina è dovuto solo alla perdita di Ca2+ dal reticolo che non può più captarlo in quanto ha la SERCA bloccata dal CPA e non può venire dall’esterno perché il mezzo extracellulare ne è privo. Gli esperimenti mostrano che nelle cellule trattate per 3 ore con C2Cer 500 nM il rilascio di Ca2+ nel citoplasma è più ampio di quello indotto in cellule cresciute per lo stesso tempo in 10% di siero. Calcolare l’integrale sotteso a questa curva significa calcolare la quantità di Ca2+ presente nel reticolo prima del suo svuotamento; mentre nel controllo la concentrazione è di circa 10 μM ± 1,37 (un valore per altro assai più basso di quello riportato in letteratura per altri modelli cellulari), dopo aver trattato le cellule per 2 ore con C2Cer 500 nM è di circa 15 μM ± 0,83 aumentando così del 45%.rispetto al controllo.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 60 80 100 120 140 160 180 Time (sec) 10% FBS C2Cer 500 nM 2h EGTA 100 uM

EGTA 100 uM + CPA 50 uM + ATP 50 uM

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 10% FBS C2Cer500 nM 2h [Ca2+ ] u M

***

l’equorinometro.

Cellule trasfettate con l’Equorina citoplasmatica ricostituita per un ora a 37°C con la celenterazina WT, sono state trattate in perfusione con CPA 50 μM e ATP 50 μM in modo da bloccare la SERCA misurando la perdita passiva di Ca2+ dal reticolo con

l’equorinometro fino al completo svuotamento del reticolo stesso. In alto sono riportate le cinetiche dello svuotamento indotto dal CPA del controllo in 10% FBS e del trattato per 2 ore con C2Cer 500 nM.

Gli istogrammi mostrano il calcolo dell’integrale sotteso alla curva di svuotamento e rappresentano il contenuto di Ca2+ del RE

Capitolo 4

DISCUSSIONE

Gli sfingolipidi sono componenti ubiquitari di tutte le membrane delle cellule eucariotiche, esiste un gran numero di questi composti, interconvertibili tra loro, le cui funzioni rimangono ancora largamente sconosciute. Mentre in passato si riteneva che gli sfingolipidi avessero esclusivamente una funzione strutturale, oggi si sa invece che agiscono come messaggeri ed inoltre che sono implicati nel regolare una grande varietà di processi biochimici. Gli effetti conosciuti di queste molecole sono estremamente vari e possono andare dalla risposta infiammatoria alla proliferazione e all’arrasto di essa, dal differenziamento alla senescenza ed alla morte cellulare.

I nostri esperimenti sono stati svolti con l’intento di chiarire quale effetto abbiano queste molecole sulla linea cellulare HN9.10e che, pur essendo una linea cellulare immortalizzata, può essere considerata un buon modello di neuroblasti ippocampali. Per valutare quale effetto avessero l’analogo membrana-permeabile della ceramide (C2Cer), la sfingosina (SP) e la sfingosina-1-fosfato (S1P) sulla vitalità della linea cellulare, abbiamo effettuato una serie di saggi “dose-risposta” nei quali abbiamo trattato le cellule per 24 ore con concentrazioni crescenti delle sostanze.

In tutti i trattamenti l’incidenza dell’apoptosi aumenta in maniera dose-dipendente sebbene nelle cellule trattate con alte concentrazioni di SP e S1P siano presenti nuclei con una morfologia differente da quella tipica descritta per la morte cellulare di tipo apoptotico. Nei campioni in cui le cellule sono state trattate con SP 10 - 25 μM o con S1P 25 μM, oltre ai nuclei apoptotici tipici sono presenti anche nuclei rotondeggianti con la cromatina che a volte appare condensata ma non frammentata mentre a volte risulta frammentata ma non condensata; in alcune cellule che presentano questi nuclei anomali, si può

osservare la perdita dell’integrità della membrana plasmatica indicando che il tipo di morte a cui vanno incontro cellule così trattate, sia di tipo misto apoptotico/necrotico. Per alcune cellule, lo stress indotto da SP e S1P 10-25 μM potrebbe essere talmente intenso e repentino da non consentire loro di mettere in atto i processi di recupero tipici delle fasi che precedono l’induzione dell’apoptosi. E’ possibile inoltre che il recupero dallo stress indotto da SP e S1P richieda un forte consumo di ATP e ne causi un brusco calo nella cellula: è stato descritto, infatti, che un consistente e improvviso calo di ATP può indurre morte di tipo necrotico, se invece è più moderato, la morte è di tipo apoptotico (Leist et al., 1997). L’effetto prodotto dalla S1P (che di norma ha un’azione anti-apoptotica), potrebbe essere in realtà indotto tramite la sfingosina: poichè la S1P prodotta fisiologicamente è molto poca, la somministrazione esogena ad alte concentrazioni potrebbe attivare immediatamente le S1P fosfatasi che, convertendola a potrebbe indurre morte cellulare.

I nostri esperimenti hanno evidenziato per la C2Cer un chiaro effetto effetto antimitogenico caratterizzato dalla progressiva riduzione dei nuclei in metafase; anche questo può essere considerato un effetto del tentativo di recupero da parte delle cellule le quali dopo aver percepito uno stimolo “nocivo” arrestano la mitosi per mettere in atto i processi di recupero.

Omeostasi del Ca2+ intracellulare in trattamenti con alte dosi di C2Cer, SP ed S1P

Negli esperimenti tesi a valutare che genere di variazioni inducessero sull’omeostasi del Ca2+ intracellulare ed in particolare su quello del reticolo endoplasmatico, la C2Cer, la SP e la S1P nella finestra temporale precedente l’apoptosi, abbiamo deciso di utilizzare la C2Cer 40 μM mentre SP e S1P sono state utilizzate alla concentrazione di 5 μM per avere effetti che non fossero il risultato di processi distinti (apoptosi o necrosi).

A questo scopo le cellule sono state trattate per 24 ore con C2Cer 40 μM e con SP e S1P 5 μM per 5 ore e poi caricate con il MagFluo-4, un probe per il Ca2+ del RE e con il Rhod- 2 che invece grazie alla sua carica positiva viene sequestrato dai mitocondri permettendoci la valutarne il Ca2+ libero.

La scelta di accoppiare questi due probes non è casuale ma è dettata dal fatto che in letteratura è ben documentato il fatto che i due comparti cellulari sono in intimi rapporti. E’ stato descritto infatti che i mitocondri si posizionano in stretta vicinanza degli IP3R ed il Ca2+ rilasciato dal reticolo può essere captato dai mitocondri che ne possono accumulare grosse quantità sotto forma di sali insolubili.

I nostri esperimenti hanno dimostrato che i trattamenti a queste concentrazioni e su tempi lunghi inducono nelle Hn9.10e una sostanziale diminuzione del Ca2+ dal RE; in questi esperimenti non abbiamo osservato nessuna variazione significativa del Ca2+ mitocondriale, ma la morfologia dei mitocondri risulta essere fortemente alterata ed in molti casi il probe si trova disperso nel citoplasma invece che essere esclusivamente nei mitocondri. Abbiamo valutato di quale entità fosse il Ca2+ mitocondriale in tempi precedenti a quelli osservati ed abbiamo trovato che la C2Cer 40 μM induce un un forte aumento nel calcio libero mitocondriale già dopo 5 ore di trattamento il quale aumenta di due volte rispetto al controllo in 10% di siero per poi diminuire dopo 24 ore e in questi campioni sono numerose le cellule con evidente blebbing di membrana e mitocondri che hanno subito swelling rigonfiandosi, perdendo l’integrità delle loro membrane e rilasciando l’indicatore nel citoplasma.

Il senso di questo processo è che i mitocondri, entro certi limiti, sono in grado di captare il Ca2+ rilasciato dal reticolo, ma il sovraccarico di Ca2+ ne causa lo swelling, caratteristico segno apoptotico. C’è da notare che non tutti i mitocondri di una cellula trattata con C2Cer 40 μM caricano quantitativi di Ca2+ tali da causarne la perdita di funzione. E’ probabile che all’interno della popolazione totale dei mitocondri di una cellula, soltanto alcuni captino

quantitativi di Ca2+ tali da causarne perdita di funzione. In questo modo la cellula è ancora in grado di generare l’ATP. Questo effetto può essere inserito nell’ambito di tutta quella serie di processi di “riduzione del danno” che la cellula eucariotica esprime quando viene sottoposta a stimoli stressogeni e nocivi.

Il Ca2+ citoplasmatico è stato monitorato su tempi brevi (2 ore) utilizzando l’indicatore ad alta affinità Fluo-3; in questi esperimenti l’indicatore Ca2+ è stato associato ad un indicatore di potenziale mitocondriale: la TMRM che ci permette anche di visualizzare la morfologia del network mitocondriale.

Gli esperimenti hanno mostrato un rapido e marcato aumento del Ca2+ citoplasmatico (l’aumento maggiore è quello indotto dalla SP) ed il segnale risulta essere poco citoplasmatico mentre è fortemente compartimentalizzato e le cellule si arricchiscono di numerose vescicole ad alto Ca2+. Con C2Cer e S1P è possibile osservare un piccolo aumento del segnale TMRM che però non risulta essere significativamente diverso dal controllo mentre invece con SP non se ne osserva alcuno. Questo effetto è dovuto al fatto che quasi tutti gli enzimi della catena respiratoria sono regolati e stimolati dal Ca2+, l’aumento citoplasmatico di Ca2+ è seguito da captazione mitocondriale. Quest’aumento almeno inizialmente va a stimolare la fosforilazione ossidativa aumentando così il potenziale mitocondriale che però rimane nel range fisiologico.

In conclusione potremmo riassumere che il trattamento con C2Cer, SP e S1P induca nelle Hn9.10e un aumento rapido del Ca2+ citoplasmatico che (almeno con la C2Cer) è seguito da un aumento del Ca2+ mitocondriale. Trattamenti prolungati con gli sfingolipidi da noi presi in esame, inducono più tardi la riduzione del contenuto di Ca2+ del reticolo endoplasmatico ed inoltre, le cellule che presentano le perdite più marcate presentano anche blebbing di membrana. Questo fenomeno è stato da noi osservato anche inducendo l’apoptosi con la deprivazione di siero, trattamento che induce morte cellulare

con contemporanea perdita di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico (Brain Reserch in progress).

Basse concentrazioni di C2Cer e di S1P inducono differenziamento

Durante gli esperimenti condotti utilizzando basse concentrazioni di C2Cer, SP e S1P abbiamo osservato un aumento di cellule che presentano sprouting neuritico: l’effetto più ripetibile e marcato si otteneva con C2Cer 2 μM e S1P 1 μM. Per questo motivo abbiamo condotto una serie di esperimenti abbassando le dosi a 500 nM per ciascun sfingolipide in modo tale da poterne escludere almeno in parte l’effetto pro-apoptotico.

Gli esperimenti hanno dimostrato che nelle HN9.10e anche dosi ridotte ma prolungate nel tempo sono in grado di indurre apoptosi eliminando però l’effetto necrotico osservato con SP e S1P ad alti dosaggi. Inoltre questi esperimenti hanno dimostrato che mentre la C2Cer ha un effetto chiaramente anti-mitogenico, riducendo progressivamente le cellule mitotiche, la S1P ha effetto pro-mitogenico aumentando il numero di cellule in metafase. Come detto in precedenza (Cfr risultati), poiché una misurazione di questo tipo ci sembrava poco sensibile, abbiamo voluto monitorare l’effetto della S1P in esperimenti di time lapse in luce trasmessa, nei quali la sostanza veniva somministrata mentre il microscopio acquisiva un immagine ogni otto minuti. Già nella prima ora dopo il trattamento numerose cellule iniziano a dividersi; anche cellule che in principio stavano allungando i neuriti, li retraggono e si dividono inoltre certe cellule si dividono ripetutamente anche dopo la prima mitosi.

Questo concorda con quello che viene riportato in letteratura sull’azione della S1P in altri modelli cellulari che descrive per questa sostanza un effetto mitogenico ed anti-apoptotico. Poiché il gruppo di Antony Futherman nel 1999 ha dimostrato che la ceramide induce l’avvio del processo differenziativo in colture primarie di ippocampo di topo e poiché la

nostra linea cellulare deriva da una fusione di cellule di ippocampo e di un neuroblastoma murino, abbiamo usato questo lavoro come riferimento e abbiamo usato lo stesso criterio di classificazione utilizzato da questi autori.

Come detto in precedenza per gli esperimenti tesi a valutare il ruolo differenziativo degli sfingolipidi, abbiamo trascurato la sfingosina in quanto gli esperimenti con questa sostanza non sempre erano riproducibili ed inoltre nelle cellule trattate con SP abbiamo osservato da subito alterazioni della morfologia e del potenziale mitocondriale facendo concentrare le nostre attenzioni su C2Cer e S1P.

Gli esperimenti hanno dimostrato che sia la C2Cer che la S1P inducono un forte sprouting neuritico stimolando la transizione dallo stato indifferenziato agli stadi 2 e 3 di Futherman: già nelle prime cinque ore di trattamento sono numerose le cellule che si arricchiscono di molti prolungamenti ed inoltre, mentre la C2Cer induce la formazione di neuriti singoli e più robusti, la S1P induce invece la formazione di lamellipodi, sottili filopodi e neuriti; inoltre mentre dopo 2 ore di trattamento con C2Cer sono già presenti neuriti di lunghezza importante, con S1P tali neuriti sono presenti solo dopo 5 ore di trattamento.

Questo probabilmente è dovuto al fatto che la S1P in un primo tempo ha effetto mitogenico sulle cellule, l’effetto differenziativo entra in gioco solo in un secondo tempo quando si è esaurito l’effetto proliferativo.

C’è da notare anche il fatto che entrambi i trattamenti accellerino la motilità cellulare: i filmati in time lapse mostrano che, dopo 24 ore di trattamento con S1P, le cellule hanno cessato di dividersi e sembrano essere alla ricerca frenetica di qualcosa: infatti con i loro prolungamenti letteralmente “tastano il terreno” alla ricerca di un probabile target. La stessa cosa è stata osservata in altre sequenze sia con C2Cer 500 nM che con la NOE 5 μM dandoci indicazione che gli sfingolipidi da noi studiati siano coinvolti nei processi di