Figura 3.18 Grafici riassuntivi nei quali è possibile vedere che dopo 72 ore di entrambi i trattamenti, sebbene
la percentuale di cellule nello stadio 3 continui a rimanere alto e i neuriti ad avere grandi dimensioni, la percentuale di cellule indifferenziate torni ad alzarsi ad indicazione che una percentuale di cellule ha iniziato a ritirare i prolungamenti che aveva emesso in precedenza.
Poiché con la somministrazione esogena dell’analogo permeabile della ceramide si perdono alcune delle peculiarità degli sfingolipidi tra cui la loro produzione transiente e localizzata (in distretti cellulari specifici), abbiamo condotto tutta una serie di esperimenti quali la C2Cer è stata rimossa dal mezzo di coltura dopo incubazioni 1ora e 30 minuti, 3 ore, oppure 4 ore. Lo scopo di questi esperimenti è duplice: da una parte cercare di mimare in modo più fisiologico il decorso temporale dell’incremento della Ceramide intracellulare, dall’altra vedere quanto a lungo la crescita neuritica si mantiene in assenza di C2Cer.
Questi esperimenti hanno mostrato che, anche a seguito di un’esposizione transiente, la C2Cer favorisce lo sprouting neuritico, promuovendo il passaggio dallo stage 1 agli agli stages 2 e 3; per la precisione mentre il transiente di 1h e 30’ non induce transizioni di stato significativamente diverse dal controllo, nel trattamento transiente per 3 ore, la percentuale di cellule indifferenziate (stage 1) passa dal 52,64% del controllo al 41,92% del trattato, le cellule di stage 2 passano dal 34,6% al 44,62 mentre quelle di stage 3 passano dal 12,75% al 13,45%. Dopo il transiente di 4 ore le differenze diventano più evidenti e il 36,67% delle cellule è indifferenziata mentre il 40,76% e il 19,5% si trovano nello stadio 2 e 3 rispettivamente.
Per quanto riguarda la lunghezza dei prolungamenti, questi passano da una lunghezza media di 15 µm nel controllo ai 40,51 µm del transiente per 3 ore ed ai 66 µm per il trattato per 4 ore.
0
Poiché la produzione di ceramide è estremamente localizzata, la somministrazione dell’analogo permeabile che agisce ovunque nella cellula è assai lontana da quella che è la generazione fisiologica di questo sfingolipide. Sempre nell’ottica di cercare di riprodurne
10 20 30 50 80 100
10% FBS trans 1.30h C2 500 nM trans 3h C2 500 nM trans 4h C2 500 nM
90 Class 1 Class 2 Class 3
NS
70***
60***
40Figura 3.19 Per cercare di riprodurre una somministrazione il più possibile simile alla produzione fisiologica
di ceramide, le cellule HN9.10e sono state trattate con transienti di C2Cer 500nM per 1 ora e 30 minuti, per 3 e 4 ore; il terreno con la C2Cer è stato poi sostituito con mezzo privo di C2Cer e le cellule fatte crescere per altre 24 ore in assenza dello stimolo.Sebbene il transiente di 1 ora e 30 minuti non induca transizioni di stato, i transienti di 3 e 4 ore invece sono sufficienti a far sì che più del 60% delle cellule presenti prolungamenti, pur avendo rimosso la C2Cer dal mezzo
la generazione fisiologica, abbiamo condotto alcuni esperimenti nei quali le Hn9.10e sono state trattate con la N-Oleil-Etanolammina (NOE) 5 μM che, inibendo la ceramidasi (l’enzima che degrada la ceramide in sfingosina), fa in modo da alzare i livelli di ceramide lì dove la cellula la sta producendo. Inoltre volendo valutare quale peso avesse nel differenziamento neuronale la sintesi de novo della ceramide, abbiamo fatto altri esperimenti utilizzando la Fumonisina B1 10 μM, un inibitore della ceramide sintasi; questo trattamento non abolisce la produzione della Ceramide in quanto rimane comunque attiva la degradazione della sfingomielina ad opera delle sfingomielinasi, ma probabilmente ne riduce il pool.
Gli esperimenti condotti con la NOE mostrano che l’aumento di ceramide prodotto dal blocco della sua degradazione ha un effetto del tutto simile a quello indotto dalla somministrazione dell’analogo membrana-permeabile: infatti già dopo due ore di trattamento le cellule indifferenziate diminuiscono del 22% a favore di quelle di classe 2 e 3 che al contrario aumentano del 70% tuttavia se l’inibitore viene lasciato nel mezzo, le cellule iniziano a retrarre i prolungamenti. Sia la percentuale di cellule indifferenziate che di quelle che presentano neuriti rimane più o meno uguale alle percentuali osservate dopo 2 ore di trattamento come d’altronde dimostrato dalla riduzione della lunghezza dei neuriti che passano dai 32 μm del trattato per 2 ore ai 25 μm del trattato per 48 ore. L’inibizione della ceramide sintasi con la FB1 non sembra avere alcun effetto se aggiunta in un terreno al 10% di siero poiché sia la percentuale di cellule indifferenziate che di quelle con prolungamenti non risulta essere diversa dal controllo in 10% FBS per gli stessi tempi.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2h 10% 2h 10%+FB1 2h 10%+NOE 48h 10% 48h 10%+FB1 48h 10%+NOE Stage 1 Stage 2 Stage 3
NS
***
***
NS
Figura 3.20 Cellule HN9.10e sono state trattate per 2 e 48 ore con l’inibitore della ceramide sintasi, la Fumonisina
B1 10 μM (FB1) e con l’inibitore della ceramidasi, l’N-Oleil-Etanolammina. Mentre l’inibizione della sintesi de novo della ceramide non sembra avere alcun effetto, il trattamento con NOE 5 μM (che equivale a far alzare la Ceramide intracellulare), induce già dopo 2 ore di trattamento, una diminuzione del 22% delle cellule indifferenziate.
Se invece cellule indotte a differenziarsi con acido retinoico vengono trattate con fumonisina B1, l’inibitore ha significativi effetti sia sulla percentuale di cellule che presentano prolungamenti che sulla lunghezza stessa dei neuriti.
Gli esperimenti svolti incubando per 24 e 48 ore le cellule con RA 1 μM e con RA 1 μM e FB1 mostrano che l’acido retinoico, dopo 24 ore di trattamento, induce differenziamento nel 43% delle cellule inducendo allo stesso tempo un aumento della lunghezza media dei neuriti che passano dal misurare in media 18 μm nel controllo ai 37 μm del trattato con RA 1 μM per 24 ore. Nei trattamenti con RA e FB1 si osserva che, mentre con RA 1 μM il numero di cellule indifferenziate è del 57% con una lunghezza media dei neuriti di 37 μm, andando ad inibire la sintesi de novo della ceramide, la percentuale delle cellule in stadio 1 risulta essere del 69,53% con una lunghezza media dei neuriti di 34 μm. L’effetto si
amplifica dopo 48 ore e mentre nei campioni con RA 1 μM le cellule indifferenziate sono il 49,56% e i neuriti misurano in media 32 μm, nel co-trattamento con RA e FB1 le indifferenziate sono il 72% ed i neuriti misurano 24,15 μm.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
24h RA 1uM 24h RA 1 uM+FB1 48h RA 1uM 48h RA 1uM+FB1
Serie1 Serie2 Serie3
***
***
Figura 3.21 Cellule HN9.10e indotte al differenziamento con RA 1μM per 24 e 48 ore e cotrattate per gli stessi
tempi con RA 1 μM e FB1 10 μM. I grafici mostrano come l’acido retinoico induca transizione dallo stato indifferenziato agli stadi 2 e 3 e mentre le indifferenziate con RA 1μM per 24 ore sono il 57%, se nel mezzo è presente anche la FB1 10 μM il numero di cellule indifferenziate sale al 69,53%. La differenza diventa ancora più visibile dopo 48 ore quando con RA le indifferenziate sono il 49,56 % mentre nel trattato con RA e FB1 sono il 72%
Che la ceramide ed i suoi metaboliti siano degli efficienti modulatori del Ca2+ intracellulare, è noto da tempo, tanto da aver ipotizzato l’esistenza di veri e propri canali Ca2+ attivati dagli sfingolipidi denominati SCaMPER la cui esistenza e funzione sono tuttora assai dibattute. Poco si sa invece delle dinamiche Ca2+ intracellulari indotte dagli sfingolipidi durante il differenziamento neuronale. Negli esperimenti di differenziamento abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulle dinamiche del Ca2+ nel reticolo endoplasmatico utilizzando diversi tipi di indicatori fluorescenti sia acetossimetilesterici che bioingegnerizzati.
Abbiamo trattato per 2 ed 8 ore le cellule HN9.10e con C2Cer, Sph e S1P 500 nM per poi caricarle con il MagFluo-4. Gli esperimenti mostrano come tutti e tre i metaboliti da noi studiati, aumentino i livelli di Ca2+ libero nel RE già dopo 2 ore di trattamento; livelli che poi diminuiscono dopo 8 ore. Per cercare di capire se il Ca2+ che nelle prime ore va a riempire il RE, sia di origine extracellulare, abbiamo trattato le cellule con gli sfingolipidi in esame ma in un mezzo con EGTA 500 μM in modo da chelare il calcio extracellulare tutto il Ca2+ presente nell’F12. Le cellule trattate in questo modo non presentano gli aumenti del Ca2+ a carico del reticolo che invece si osservano in cellule coltivate nel mezzo con il Ca2+.
2h C
2Cer 500 nM
2h Sph 500 nM
2h S1P 500 nM
10% FBS
25 μm
MagFluo-4
2h C
2Cer 500 nM
2h Sph 500 nM
2h S1P 500 nM
10% FBS
25 μm
2h C
2Cer 500 nM
2h Sph 500 nM
2h S1P 500 nM
10% FBS
2h C
2Cer 500 nM
2h Sph 500 nM
2h S1P 500 nM
10% FBS
25 μm
MagFluo-4
Figura 3.22 Cellule HN9.10e in 10% di siero e trattate per 2 ore con C2Cer, SP e S1P, poi caricate per 30 minuti in vivo con l’indicatore Ca2+ a bassa affinità MagFluo-4 AM specifico per il reticolo endoplasmatico0 1 2 3 4 5 10%FBS 2h 8h
C
2Ceramide
Figura 3.23 Quantificazione del
segnale MagFluo-4 di cellule trattate per 2 e 8 ore con C2Cer, SP ed S1P 500 nM.
I grafici mostrano come tutti i trattamenti, dopo 2 ore inducano aumento del segnale MagFluo-4 che triplica nel trattato con C2Cer .mentre raddoppia con SP ed S1P. Questo aumento temporalmente coincide con la fase nella quale le cellule iniziano ad emettere i prolungamenti
Dopo 8 ore con C2Cer e 6 ore con SP ed S1P il segnale scende sensibilmente ed alcune cellule iniziano a presentare segni di stress. 0 1 2 3 4 5 10%FBS 2h 6h
Sfingosina
0 1 2 3 4 5 10%FBS 2h 6hSfingosina-1-P
Poiché l’aumento del Ca2+ nel RE dopo 2 ore coincide con l’inizio dello sprouting e poiché da osservazioni frequenti sappiamo che le cellule in crescita hanno in media livelli di Ca2+ più alti delle altre cellule, ci siamo chiesti se l’alto Ca2+ nel RE non sia in qualche modo correlato al differenziamento cellulare; abbiamo così trattato le cellule con un noto agente differenziativo: l’acido retinoico (RA 1μM per 4 ore) per vedere quale effetto avesse sul
Ca2+ del RE. Gli esperimenti hanno mostrato un chiaro ed ampio innalzamento del segnale MagFluo-4.
10% FBS
RA 1 μΜ
25 μm
Figura 3.24 Cellule trattate per 4 ore con RA 1uM e poi caricate con il MagFluo-4 che mette in evidenza
l’aumento di Ca2+ nel reticolo endoplasmatico rispetto al controllo in 10% di siero
Se alti livelli di Ca2+ nel reticolo sono in qualche modo correlati al differenziamento neuronale, allora l’aumento artificiale del contenuto di Ca2+ nel RE dovrebbe indurre un qualche genere di sprouting.
Partendo da questa ipotesi abbiamo utilizzato Dantrolene e Rianodina per inibire la fuoriuscita di Ca2+ dal RE (la Ryanodina utilizzata in concentrazioni superiori a 10 μM blocca il canale a lei sensibile in posizione chiusa).
In esperimenti nei quali le cellule sono state incubate per 5 ore con Dantrolene 20mM e Rianodina 10μM il carico di Ca2+ nel reticolo risulta maggiore che nel controllo; i preparati così trattati mostrano significative diminuzioni delle cellule indifferenziate con contemporaneo aumento delle cellule nello stadio 2 e 3. Più precisamente le cellule indifferenziate passano dall’88,5 % ± 2,93 del controllo al 35,8 % ± 4,2 del trattato per 5 ore con Dantrolene 20 mM ed al 41,08 % ± 4,33 nel trattato con Ryanodina 10 μM. Questo effetto risulta essere transitorio, poiché dopo 24 ore le cellule iniziano a morire.