Number of obs 134 F(7, 126) 14.19 Prob > F 0.000 R-squared 0.440 Adj R-squared 0.409 Root MSE 3.335 Number of obs 147 F(15,131) 11.80 Prob > F 0.000 R-squared 0.5746 Adj R-squared 0.5259 Root MSE .4486 IGA 0.003 CD19 0.001 Mg 0.003 IL5 0.000 GPX 0.138 GGT 0.166 LDH 0.023 PLT 0.002 GALFA2 0.000 FOLATI 0.083 vitB12 0.000 PT 0.001 IL6 0.071 IL12 0.001 Prealbumina 0.102 Calcio 0.024 Ferritina 0.107 Prealbumina 0.039 AST 0.000 GGT 0.171 LDH 0.016 IGA 0.126
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MCI vs DATb
MCI vs DATa
Figura 4.10. (2) Risultati dell’analisi statistica per ogni gruppo di analiti nei 3 gruppi di pazienti DATa, DATb, MCI. Per ogni analisi viene indicato il numero di osservazioni prese in considerazione, i parametri dell’analisi (F, R-squared, Adj R-squared, ROOT MSE), gli analiti non significativi in rosso, e quelli risultati significativi correlati con la CDR in nero con relativo
valore di significatività p value (Prob > F). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software Stata (versione 10.0, Stata Corporation, College Station, TX77845, USA): un valore di
p value di 0,05 è stato considerato statisticamente significativo
Number of obs 71 F(12,58) 11.14 Prob > F 0.000 R-squared 0.697 Adj R-squared 0.634 Root MSE .2353 Number of obs 89 F(17, 71) 12.19 Prob > F 0.000 R-squared 0.744 Adj R-squared 0.683 Root MSE .3994 Transferrina 0.050 Ca 0.088 Mg 0.000 IL5 0.000 CD19 0.000 GGT 0.023 Prealbumina 0.095 CK 0.040 Galfa2 0.004 IGA 0.000 vitB12 0.000 PT 0.020 IL6 0.115 GPX 0.005 IGM 0.164 Ferritina 0.016 PLT 0.088 IGM 0.000 PLT 0.177 IL6 0.011 PTT ratio 0.067 GPX 0.128 GGT 0.000 Ferritina 0.084 CK 0.030 Galfa2 0.046 Folati 0.004 vitB12 0.030 CD19 0.000
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5.DISCUSSIONE
Questo lavoro si è dedicato alla ricerca di possibili biomarcatori per diagnosticare l’insorgenza e seguire l’iter della malattia di Alzheimer. Considerando che la neuroinfiammazione possa essere uno dei principali meccanismi nella patogenesi dell’AD, abbiamo effettuato una analisi sul valore predittivo e di monitoraggio di biomarcatori che contribuiscono ai processi infiammatori.
La nostra attenzione si è rivolta inizialmente alla valutazione della presenza nei neuroni di l’IFN- β, un componente cruciale della attivazione della risposta immunitaria innata agli agenti patogeno-infettivi. Poiché attualmente è estremamente difficile determinare l’IFN- β nei neuroni del cervello, nella prima parte della tesi abbiamo studiato i linfociti periferici come sentinella di tale attivazione. Molteplici studi suggeriscono infatti che il SNC è accessibile ai linfociti e monociti dal flusso sanguigno, attivando in tal modo un intenso cross-talk tra il sistema immunitario e i neuroni del SNC (Wojda et al., 2016). Alcune proteine o metaboliti derivati dai neuroni cerebrali dei pazienti AD attraverso i linfociti possono superare la barriera emato-encefalica patologica-permeabile (maggiore con l’avanzare dell’età), entrare nel plasma e trasportare importanti informazioni per la diagnosi/prognosi dell’AD.
Nel nostro lavoro abbiamo studiato i linfociti di pazienti DAT a diversi stadi della malattia. All’ interno dei linfociti è stata valutata l’espressione dell’OAS1, una delle principali proteine ad azione antivirale indotte da l’IFN- β (Salder et al.,2009).
Dai risultati preliminari abbiamo dimostrato che i linfociti di pazienti DAT hanno una marcata attivazione della risposta l’IFN- β rispetto ai controlli misurata come espressione dell’OAS1, dimostrando una stretta correlazione con la gravità della malattia.
Nella ricerca di biomarcatori facilmente accessibili con test non invasivi per la diagnosi e la prognosi dell’AD, i miRNA sono tra i candidati più promettenti. I miRNA sono piccoli RNA non codificanti coinvolti nella regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica. L ‘alterazione dell’espressione dei miRNA è stata associata a diversi processi patologici, inclusa la neurodegenerazione (Femminella et al., 2015). A
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tal proposito, abbiamo valutato all’ interno di linfociti l’espressione di un miRNA proinfiammatorio, il miRNA 155, ma la media dei livelli d’espressione del miRNA155 non risulta significativamente indotta in pazienti DAT rispetto ai controlli, quindi all’interno questo sistema cellulare non c’è una correlazione con la OAS1.
Mentre la presenza di miRNA nei neuroni compreso il miRNA 155 è stata descritta in precedenza (Femminella et al., 2015), il loro ruolo nei diversi stadi della malattia e come si muovono nell’organismo è ancora relativamente sconosciuto (Harrison et al., 2017).
Poiché gli esosomi sono i principali carrier di miRNA è stata intrapresa una valutazione della morfologia e del contenuto di esosomi estratti da sangue periferico. Attualmente gli esosomi sono considerati un esteso sistema di comunicazione intercellulare a distanza in grado di internalizzare, trasportare e trasferire tutti i tipi di biomolecole, dagli acidi nucleici ai peptidi e alle proteine (Pulliam et al., 2019). In seguito all’identificazione di alcune proteine neurodegenerative contenute negli esosomi, queste vescicole sono state proposte come possibili biomarcatori per monitorare la progressione della malattia (Soria et al., 2017). I miRNA trasportati all’interno di esosomi derivati da neuroni possono attivare le funzioni delle cellule gliali, come la fagocitosi microgliale per la clearance dei dendriti neurodegeneranti (Bahrini et al., 2015). Nello specifico in questo studio, abbiamo analizzato l’espressione del miRNA 155 all’ interno di esosomi estratti dal siero di pazienti DAT, che è risultata essere significativamente indotta rispetto ai dei controlli. In letteratura sono riportati studi su come gli esosomi stimolano il sistema immunitario e regolano la risposta immune (De Toro et al., 2015). Un’analisi di OAS1 potrà indicare se gli esosomi in questi pazienti sono trasportatori del sistema della risposta immunitaria innata.
Per quanto riguarda la caratterizzazione degli esosomi dei pazienti Alzheimer, abbiamo utilizzato la tecnica della spettrometria di massa allo scopo di individuare proteine specifiche per l’AD, ma abbiamo avuto una risposta ambigua, sia mascherata dal gran numero di proteine plasmatiche rimaste nel campione durante l’estrazione, inoltre le cellule neuronali sono lo 0,3% delle cellule totali del corpo e probabilmente producono esosomi rispecchiando la stessa percentuale. È stato riportato che gli
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esosomi di origine neuronale nel sangue sono al di sotto del 10% di quelli totali (Mustapic et al., 2017). Abbiamo quindi deciso di isolare gli esosomi neuronali da quelli totali circolanti nel plasma di pazienti e controlli sui quali abbiamo effettuato una serie di analisi per la loro caratterizzazione. Attraverso l’utilizzo della microscopia elettronica abbiamo osservato forti differenze nella forma e dimensione tra esosomi controllo totali e neuronali ma in particolar modo tra gli esosomi DAT totali e neuronali che sono risultati essere di dimensioni nettamente inferiori sia rispetto a quelli totali che a quelli provenienti dai controlli arricchiti. Tali differenze sono state confermate anche dal Nanosize. Spesso vengono riscontrate alterazioni nelle dimensioni degli esosomi ma ancora non è stata data una spiegazione univoca (De Toro et al., 2015)
Negli esosomi di origine neuronale, è stata valutata l’espressione del miRNA155 risultando più significativa rispetto all’ espressione del miRNA 155 negli esosomi totali.
Partendo da un data-base da noi elaborato, contenente tutti i dati anagrafici, clinici e biochimici relativi ai pazienti, abbiamo effettuato una analisi di statistica descrittiva seguita da analisi Anova-Bonferroni e regressione lineare, per evidenziare i valori del sangue più significativi che correlano con la gravità della malattia. L’analisi statistica è stata eseguita in 14 pazienti MCI, 32 pazienti DATa e 23 pazienti DATb.
Poiché l’overespressione del miR-155 aumenta la risposta di alcune famiglie linfocitarie in vivo, abbiamo controllato questa relazione sul data base verificando la deregolazione dell’espressione del marker dell’autoimmunità CD19 (Zheng et al., 2018)
Sia la OAS1 che il Mir-155 possono essere considerati un biomarcatori per la valutazione della malattia con un test non invasivo e relativamente semplice effettuato negli esosomi periferici.
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6.CONCLUSIONI
Poiché la malattia di Alzheimer è una malattia degenerativa in continuo aumento nella popolazione, è sempre più necessario incrementare la ricerca per l’acquisizione di nuove conoscenze e di potenziali percorsi terapeutici. In questo studio abbiamo identificato biomarcatori che potrebbero essere dei target diagnostici in quanto correlano con la gravità della malattia. Tra questi abbiamo evidenziato che i linfociti e gli esosomi potrebbero essere ottimi biomarcatori, che con metodiche relativamente semplici offrono dati per la valutazione dell’insorgenza e progressione della malattia di Alzheimer e possono essere usati come possibili agenti terapeutici.
Uno degli obiettivi raggiunti durante lo svolgimento di questa tesi è stato l’allestimento di un database generale contenente tutti i parametri biochimico-clinici di un centinaio di pazienti DAT che ripetono visite ed analisi periodicamente. Tale database ci ha permesso di valutare alcuni analiti che correlano significativamente con la malattia, e in futuro creando dei sottogruppi a partire quello (citochine, fattori trofici, antiossidanti ecc..) si potranno effettuare studi statistici e nuove correlazioni. Proseguendo gli studi in questa direzione intendiamo dare un contributo alla ricerca di metodi poco invasi per la diagnosi della malattia.
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