I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole di RNA non codificanti ed evolutivamente conservate. Presentano un singolo filamento, di lunghezza compresa tra i 18 e i 25 nucleotidi, svolgono un ruolo di regolazione dell’espressione genica a livello post-trascrizionale. (Faraoni et al., 2009)
Indirizzano le trascrizioni dell'mRNA attraverso l'associazione di base complementare al 3 'UTR, ciò causa una degradazione dell'mRNA target o un'inibizione traslazionale, consentendo ai miRNA di regolare il proteoma cellulare. (Harrison et al., 2017)
Attraverso questo meccanismo i miRNA sono coinvolti in quasi tutti i processi biologici, come la proliferazione, lo sviluppo, l’apoptosi, l'infiammazione e la loro espressione è altamente regolata, sia da enzimi che stabilizzano i miRNA maturi che da meccanismi epigenetici come la metilazione del DNA o la modificazione dell'istone. (Femminella et al.,2015)
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La biogenesi del miRNA è un processo a più fasi che avviene attraverso numerose modifiche post-trascrizionali. Inizia nel nucleo e termina nel citoplasma. (Figura 9)
Trascrizione
Primo enzima a prendere parte al processo è l'RNA polimerasi II che trascrive nel nucleo geni di miR generando lunghi trascritti primari (pri-miRNA) che possono contenere da uno a sei precursori per miRNA. Essi subiscono un processo di capping in posizione 5 'e di poliadenilazione 3'.
Processamento
Il pri-RNA presenta una struttura a doppio filamento la quale viene riconosciuta dalla proteina del nucleo nota come: DiGeorge Syndrome Critical Region 8 (DGCR8 o "Pasha" negli invertebrati) che si associa alla RNAasi di tipo III Drosha formando il “complesso microprocessore”. I pri-miRNA vengono successivamente tagliati dal microprocessore in pre-miRNA della lunghezza di 70-120nucleotidi.
Esportazione dal nucleo e processamento nel citoplasma
I pre-miRNA vengono poi esportati in citoplasma da exportin-5 grazie ad un trasporto attivo che utilizza come fonte di energia GTP legato alla proteina Ran (36). Nel citoplasma l’RNAasi di tipo III Dicer, associata ad una proteina cellulare TRBP e la proteina PKR-attivante (PACT), iniziano a processare il pre-miRNA formando molecole di RNA a doppio filamento lunghe circa 18-23 nucleotidi.
Un filamento viene selezionato sulla base della stabilità dell'estremità 5’ (filamento di guida) mentre l'altro capo (filamento passeggero) è solitamente degradato. A questo punto il miRNA viene caricato nel complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) contenente le proteine Argonaute (AGO), TNRC6A, e altre proteine leganti l’RNA. Il filamento incorporato in RISC interagisce con RNA bersaglio; infatti il miRNA si lega all’mRNA target per degradarlo o per inibire la traduzione.
La degradazione dell'mRNA bersaglio si verifica solo quando il miRNA e l'mRNA bersaglio sono esattamente (corrispondenza perfetta) o quasi esattamente complementari tra loro; infattise la complementarità tra miRNA e l'mRNA bersaglio è solo parziale (corrispondenza imperfetta), la traduzione verrà repressa. È stato
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stimato che una singola molecola di miRNA è in grado di legare circa 200 diversi trascritti. (Faraoni et al., 2009)
Figura 9. Biogenesi dei miRNA
1.8.1 miRNA 155 e Alzheimer
La maggior parte dei miRNA sono situati livello intracellulare ma, un numero significativo di miRNA è stato osservato al di fuori delle cellule, tra cui vari fluidi corporei (Hanson et al., 2009). I miRNA infatti possono essere trasportati al di fuori delle cellule e trovarsi così in diversi fluidi biologici quali: plasma, siero, saliva, urine, lacrime, latte materno. Questi miRNA extracellulari chiamati anche circolanti, vengono utilizzati come indici diagnostici extracellulari per alcune patologie. Il miRNA una volta maturo può essere incorporato nel RISC e appaiare con il suo mRNA target e reprimerne la traduzione o indurre la sua degradazione; oppure il miRNA maturo può essere esportato fuori dalla cellula e trasportato da 5 diversi carrier: esosomi, microvescicole, corpi apoptotici, proteine leganti l’RNA e HDL.Vengono inclusi in questi carrier poichè contengono RNA nudo, altamente instabile e soprattutto
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bersagliato dalle diverse esonucleasi presenti nei fluidi extracellulari. I miRNA circolanti rappresentano una nuova forma di comunicazione intracellulare attraverso il trasferimento di informazioni genetiche da una cellula donatrice ad una ricevente. (Kinet et al.,2013)
L'alterazione dell'espressione dei miRNA è stata associata a diversi processi patologici, inclusa la neurodegenerazione; infatti è stato dimostrato che specifici miRNA sono espressi nel sistema nervoso centrale (SNC), dove regolano la differenziazione neuronale, la plasticità sinaptica e la crescita dei neuriti. Nella ricerca di biomarcatori facilmente accessibili e non invasivi per la diagnosi e la prognosi della malattia di Alzheimer (AD), i miRNA sono ottimi candidati (Femminella et al.,2015). Nel nostro studio l’attenzione è stata focalizzata in particolar modo sul miR-155. Il miR-155 è generalmente considerato un miRNA multifunzionale. Viene trascritto da un gene non codificante denominato gene BIC, che è altamente conservato in molte specie e ampiamente espresso in vari organi, tessuti e tipi di cellule, indicando la sua versatilità funzioni in vari processi biologici. È stato dimostrato svolgere ruoli importanti in condizioni fisiologiche (per esempio, circolazione, emopoiesi, immunità e infiammazione), come nonché condizioni patologiche (ad es. malattie neoplastiche e disturbi cardiovascolari).
In diversi studi inoltre, è stato confermato che il miR-155 è sovraregolato durante l'infezione virale, è infatti un regolatore positivo del segnale JAK / STAT mirando, nei macrofagi, a SOCS1(soppressore della segnalazione di citochine 1), un regolatore canonico negativo di segnalazione IFN di tipo I. Questo meccanismo porterà non solo ad un aumento dell'espressione di geni antivirali indotti da IFN I come l’OAS 1 ma anche una risposta positiva nell'immunità innata antivirale dell’ospite. (Chenhe et al.,2011)
La letteratura scientifica riporta che l'espressione di miR-155, mediata da recettori Toll-like, aumenta le linee cellulari monocitiche durante l'infiammazione lipopolisaccaride (LPS). Una volta avvenuto il riconoscimento dei patogeni da parte dei recettori Toll-like su monociti o macrofagi, il miR-155 regola l'infiammazione acuta, entrando a far parte in questo modo nell'immunità innata. È suggerito anche che il miR-155 sia associato alle funzioni delle cellule T regolando il TCR e la
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produzione di citochine infiammatorie; queste prove suggeriscono che miR-155 è coinvolto nelle funzioni immunitarie delle cellule T e quindi nell'infiammazione anche durante l'AD. Sembra infatti che il miR-155 possa regolare la differenziazione, la proliferazione e l'attivazione delle cellule Th1, Th2 e Th17, Treg e CD8+ nello stato infiammatorio. (Juhyun et al., 2015) (Figura 10)
Figura 10. miR-155 è coinvolto nella risposta delle cellule T.Le cellule Th1 aumentano l'espressione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II e CD86 in cellule presentanti l'antigene come i macrofagi. Le cellule Th1 Aβ-reattive aumentano la secrezione
di citochine infiammatorie come IFN-γ e TNF-α.
MiR-155 è associato inoltre a specifici geni di trascrizione che regolano l'attivazione delle cellule T; sembra modulare l'attivazione e la proliferazione delle cellule Treg durante l'infiammazione, inducendo FOXP3, inoltre regola la fosforilazione di STAT5 e SOCS1.
Regola anche SHIP1 che aumenta la sopravvivenza delle cellule T modulando la produzione di IFN-γ. (Song et al.,2015) (Figura 11)
36 Figura 11. Geni target del miR-155 che regolano l’attivazione delle cellule T
Tutti questi risultati dimostrano che miR-155 è un miRNA proinfiammatorio, coinvolto in processi quali infiammazione e immunità, è up-regolato sia nei liquidi extracellulari, sia nel liquido cerebrospinale dei pazienti AD regolando le risposte immunitarie e infiammatorie innate nel cervello dell’AD. (Femminella et al., 2015)