3.1.5 Quantificazione RNA / DNA/ proteine
3.4 SDS PAGE per l’analisi di estratti proteici.
Per SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, si intende l’elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato. È una tecnica analitica utilizzata per separare le diverse proteine di una miscela e determinarne il peso molecolare.
L’ analisi può avvenire mediante colorazione, autoradiografia e densiometria.
La procedura da noi utilizzata è basata sulla colorazione mediante Blue di Coomassie (sensibile fino ad 1 µg di proteina), o con nitrato d’ argento, Silver Solution (sensibile fino a 10 ng di proteina).
Preparazione della camera
Vengono prese due lastre di vetro dello spessore di 0,75mm e vengono disposte verticalmente nel supporto per la gelificazione; si viene a formare così uno spazio di circa 1mm di spessore a forma di lastra rettangolare delimitato avanti e dietro da due vetri.
All’ interno dello spazio viene versato il gel.
Preparazione del gel
Nel SDS-PAGE, viene utilizzato un gel discontinuo composto da:
• Stacking gel: è la parte superiore del gel nel quale si formano i pozzetti in cui vengono
messi i campioni; la dimensione dei pozzetti creati nel gel è inversamente proporzionale alla concentrazione di poliacrilammide. Ad esempio, un gel di poliacrilammide al 7% ha pori più grandi di un gel di poliacrilammide al 12%. Rappresenta il punto di partenza dei campioni per la loro migrazione.
Running gel: è la parte inferiore del gel, separa le proteine dei vari campioni sulla base
del loro peso molecolare.
La preparazione del running gel consiste nell’ utilizzo di:
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ml di gel usiamo la formula V1xC1 = V2xC2 che darà 1,5 ml • Buffer tris HCL 1,5 M a PH 8,8: 1,25 ml
• H20: 2,25 ml
Vengono inseriti in un baker e posti su piastra magnetica con un’ancorina poiché a questa soluzione vengono aggiunti dei catalizzatori:
• APS: 30 µl • TEMED: 5 µl
Da questa soluzione vengono prelevati 5 ml e inseriti tra le due piastre di vetro della camera, si lascia riposare una trentina di secondi e viene poi messo 1 ml di isopropanolo per ottenere una superficie piatta.
L’ isopropanolo viene poi aspirato e viene posto 1 ml di stacking gel, il quale ha una minore concentrazione di acrilammide (7%) un PH più basso e un diverso contenuto ionico. Ciò consente alle proteine del campione caricato di essere concentrate in una banda stretta durante i primi minuti di elettroforesi prima di entrare nel running gel.
Stacking gel:
• Acrilammide al 4% (soluzione di partenza al 40%): 0,5 ml • Buffer 0,5 M Tris HCl a PH 5,8:
• H20:
A cui verrà aggiunto: • APS: 15 µl
• TEMED: 5 µl
Prima che il gel polimerizzi viene inserito un “pettine” di plastica per 0,75 mm per formare i pozzetti. Quando il gel sarà pronto, verrà messo nella cella elettroforetica costituita da due vasche a contatto con le due estremità del gel; tali vasche, contenenti ciascuna un elettrodo, sono riempite di una soluzione tampone. Caricati i campioni, tra i due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale; i campioni vengono poi visualizzati attraverso opportuni metodi di colorazione o di rilevazione.
62 Figura 3.2.6 Preparazione per la corsa elettroforetica SDS-PAGE
3.2.5 Rilevazione delle proteine
Per rilevare le proteine dopo la separazione elettroforetica su gel di poliacrilammide effettuiamo una colorazione Blue Coomassie e Silver Solution.
Blue Coomassie
La colorazione con Blue Coomassie (R-250 e G-250) si lega alle proteine attraverso interazioni ioniche tra i gruppi acidi solfonici e i gruppi amminici delle proteine, oltre che tramite legami di Van der Waals.
Protocollo
• Immergere il gel nella Fixing Solution per 30 minuti. La Fixing Solution è data da 50% di H20, 10 % di acido acetico, 40 % di metanolo
• Immergere il gel nella Blue Coomassie Solution e lasciarlo colorare per 10-15 minuti. • Risciacquare tramite acqua distillata al fine di eliminare l’eccesso di colorante nella
soluzione.
• Decolorare il gel con la Destaining Solution, sostituire una volta e far decolorare per una intera notte.
Sciacquare il gel tramite acqua distillata e avvolgerlo in un foglietto protettivo o disidratarlo per la conservazione.
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Silver Solution
Gli ioni d'argento (dal nitrato d'argento nel reagente di colorazione) interagiscono e si legano con alcuni gruppi funzionali proteici. Le interazioni più forti si verificano con gruppi di acidi carbossilici (Asp e Glu), imidazolo (His), sulfidrili (Cys) e ammine (Lys). Ne risulta in un colore marrone-nero.
Reagenti
• Silver Solution: data da 0,1% AgNO3 in H20: 0,1 g AgNO3 sciolti in 100 ml di H2O
• Developing Solution: necessaria per convertire l’argento in argento metallico, è data
da 3 % di carbonato di sodio (NA2CO3) in H2O a cui vengono aggiunti 50 µl di
formaldeide per 100 ml. Agitare per due minuti
Protocollo
Dopo aver messo il gel in una vaschetta, fare un primo lavaggio in metanolo al 50% ed un Il secondo lavaggio in metanolo al 5%.
• Aggiungere DDT 32µM al gel e lasciar agire per 15 minuti; una volta rimosso il DDT si effettuano due lavaggi con H2O per 5-10 secondi.
• Aggiungere Silver Solution e lasciar agire per 15 minuti; rimuovere la silver solution e fare due lavaggi con H2O per 5-10 secondi.
• Lavare due volte con la Developing Solution, rimuoverla e aggiungere la restante parte.
• Incubare su un agitatore fino a quando non si vedano le bande
• Al gel in soluzione viene aggiunto Acido Citrico fino a quando non cessa il frizzing
•
Lavare con H20 e lasciar incubare in essa cambiandola di tanto in tanto.3.2.7 Arricchimento di esosomi di origine neuronale da plasma
Durante la spettrometria di massa è emerso il problema sia della contaminazione degli esosomi da proteine ematiche sia la presenza di esosomi aspecifici derivanti da
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tutti i compartimenti corporei, considerando che quelli di origine neuronale sono solo il 10%. (Mustapic et al.;2017)
Quindi abbiamo deciso di procedere con l’arricchimento neuronale mediante la
“Immunoplate for Neuronal derived exosome capture and enrichment from human plasma” della HansaBioMed, rivestita con anticorpi monoclonali L1CAM di topo.
I campioni di plasma vengono fatti scongelare a temperatura ambiente. Una volta in fase liquida, vengono sottoposti a due centrifugazioni per eliminare eventuali globuli rossi e detriti cellulari:
• 1200 x g per 20 minuti;
• 10000 x g per 30 minuti.
Dopo ogni step viene recuperato il sovranatante e trasferito in una nuova eppendorf. A questo punto, il plasma viene diluito 1:1 in PBS 1X.
Viene aggiunto 100µl di campione (plasma + PBS) in ogni pozzetto della piastra. Coperta con parafilm, viene messa in incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente sullo shaker. Dopo di che si procede con uno step di incubazione overnight a 4°C.
A questo punto si procede con gli step di lavaggio, aggiungendo 200µl di washing buffer (PBS + 0,05% Tween20) in ogni pozzetto. Si scarica il contenuto della piastra e si procede con altri 3 step di lavaggio mediante l’aggiunta di 300µl di washing buffer. Ora possiamo procedere con la lisi degli esosomi direttamente dalla piastra per l’estrazione dell’RNA mediante Trizol (vedi paragrafo 3.1.5) oppure possiamo aggiungere il “Beads elution buffer”, che permette il distacco degli esosomi legati dagli anticorpi e la loro eluizione per ulteriori analisi. Si inseriscono 20µl di buffer e si lascia in incubazione 5 minuti sullo shaker. Quindi si aggiungono 30µl di PBS in ogni pozzetto e si recupera tutto il contenuto in una eppendorf. Gli esosomi di origine neuronale saranno ora in sospensione.
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