Determinazione dell’attività antiossidante in funzione della temperatura

L’attività antiossidante delle matrici sintetizzate, dipende dalla quantità dei gruppi fenolici disponibili (TFG) che sono in grado di interagire, inibendoli, con i radicali liberi, pertanto la determinazione di tali gruppi è alla base della descrizione di una matrice che debba presentare caratteristiche preservanti nonché antiossidanti. Il saggio di Folin-Ciocalteau con opportune modifiche è stato scelto per determinare questo parametro a diverse temperature (Spizzirri e al., 2010). Il reagente di Folin-Ciocalteau contiene un derivato del Mo (VI) che viene facilmente ridotto dai gruppi fenolici a una specie che assorbe specificatamente ad una stabilita lunghezza d’orda del visibile. Il reattivo è costituito da una miscela di acido fosfotungstico e acido fosfomolibdico, che per reazione con i fenoli, si riducono rispettivamente a ossido di tungsteno e ossido di molibdeno dal tipico colore blu, con un massimo di assorbimento a 760 nm. Ponendo a contatto ogni idrogel sintetizzato (PB, PC e PQ) con tale reagente a due diverse temperature (25 e 40°C) sono stati registrati i dati riportati in Tabella 5.4 che riporta i gruppi fenolici disponibili espressi come equivalenti di CT (o QE) (mg per g di polimero). In tali esperimenti appare evidente come il polimero PB, mancante di gruppi funzionali che possano interagire con il reattivo, non interferisce con la determinazione.

Tabella 5.4: Proprietà antiossidanti degli idrogel sintetizzati.

Idrogel Proprietà antiossidanti TFG (mg/g) ABTS IC50 (mg/mL) DPPH IC50 (mg/mL) 25°C 40°C 25°C 40°C 25°C 40°C PB - - - PC 1,3 ± 0,2 0,8 ± 0,7 4,45 ± 0,3 15,2 ± 0,4 2,6 ± 0,1 19,3 ± 0,2 PQ 1,0 ± 0,1 0,5 ± 0,1 25,2 ± 0,4 61,4 ± 1,0 12,2 ± 0,1 -

I dati registrati mostrano per entrambi i polimeri una maggiore quantità di TFG a 25°C, poiché l’interazione tra le matrici, che si trovano nello stato rigonfiato, e il reattivo risulta massimizzata. In particolare, la differenza tra le due matrici (1,3 and 1,0 mg di flavonidi per PC e PQ, rispettivamente) alla stessa temperatura è una conseguenza della diversa reattività del flavonoide durante il processo di grafting molecolare. Innalzando la temperatura a valori superiori alla LCST si osserva il collasso dell’idrogel e di conseguenza i gruppi fenolici presenti risultano meno accessibili al reattivo utilizzato (0,8 e 0,5 mg di flavonidi per PC e PQ, rispettivamente). Il risultato finale è che il valore di TFG registrato diminuisce sensibilmente.

Per poter valutare la capacità scavenger degli idrogel sintetizzati, sono stati allestiti due saggi di inibizione radicalica, utilizzando il DPPH come radicale lipofilo e il radicale cationico ABTS come idrofilo. In entrambi i casi, l’aggiunta di molecole antiossidanti ne determina la loro riduzione per trasferimento di idrogeno o di elettroni da parte dell’agente antiossidante al radicale utilizzato, che a livello macroscopico si traduce in una variazione di assorbanza attraverso la quale è possibile quantificare la capacità antiossidante delle sostanze in esame, dal momento che la variazione dell’assorbanza è proporzionale alla quantità di antiossidante presente. Al fine di valutare la modulabilità delle proprietà antiossidanti delle matrici realizzate, i test sono stati eseguiti a due diverse temperature (25 e 40°C), cui le matrici si trovano rispettivamente nello stato rigonfiato e collassato.

Il test del DPPH ci consente di apprezzare una graduale decolorazione della soluzione etanolica di DPPH, originariamente rosso porpora, quando è a contatto con sostanze antiossidanti in grado di ridurre il radicale stesso. La misurazione spettrofotometrica avviene a 517 nm, valore riconducibile alla banda caratterizzata dal massimo assorbimento del radicale (Pyrzynska e Pȩkal, 2013). La riduzione di assorbanza registrato a questa lunghezza d’onda risulta direttamente proporzionale all’effetto antiossidante del materiale testato.

Il test dell’ABTS permette la valutazione dell’attività scavenger dei materiali in ambiente acquoso, attraverso la misurazione di una graduale decolorazione della soluzione contenente il radicale ABTS .+ blu-verde che assorbe ad una specifica lunghezza d’onda pari a 734 nm, quando è posta a contatto con molecole antiossidanti. Anche in questo caso il test è stato condotto sia a 25°C che a 40°C.

Per entrambi i saggi, il risultato è stato espresso come IC50, cioè la quantità di antiossidante in

grado di ridurre del 50% la concentrazione iniziale di DPPH (Figura 5.6A) e ABTS (Figura 5.6B). I valori di IC50 sono riportati in Tabella 5.4,

Figura 5.6: Inibizione DPPH(%) e ABTS(%) per PB (♦); PC (■); PQ (▲) a 25°C (_ _ _) e 40°C (____).

In entrambi i saggi, la capacità antiossidante di PB non è rilevante in quando non è presente alcun effetto scavenger né verso radicali idrofili, né verso radicali lipofili, il ché è ovvio dal momento che manca, nella propria struttura, di componenti aventi proprietà antiossidanti. Gli idrogel contenenti le porzioni antiossidanti, invece, mostrano una buona attività scavenger nei confronti di entrambi i radicali, con effetti più pronunciati a 25°C, temperatura alla quale le funzioni fenoliche risultano più accessibili. Andando ad analizzare le differenze tra i due polimeri alla stessa temperatura appare chiaro come la matrice PC sia più performante rispetto a PQ nei confronti di entrambi i radicali. Inoltre, la matrice contenente CT presenta proprietà antiossidanti meglio esplicate nei confronti del radicale lipofilo rispetto a quello idrofilo. In presenza del radical DPPH alla concentrazione pari a 2,5 mg/ml di matrice PC è registrata un’inibizione del 50%, che supera il 75% per concentrazioni di 10 mg/ml, l’inibizione si mantiene al di sopra di questo valore per tutte le altre concentrazioni utilizzate, fino a raggiungere un valore costante di poco superiore all’85%, per concentrazioni superiori a 20 mg/ml; in presenza, invece, del radicale ABTS+ occorre una concentrazione poco superiore ai 10 mg/mL per avere un’inibizione del 50% e per raggiungere il 75% di inibizione, occorre utilizzare concentrazioni pari a 20 mg/ml, solo dopo la concentrazione di 25 mg/ml si apprezza un’inibizione superiore al 75% che diviene pressoché costante quando la concentrazione di PC è 50 mg/ml.

Anche per la matrice PQ si ha un’ottima capacità scavenger per entrambi i radicali alla temperatura di 25°C, ma, in questo caso occorre precisare due aspetti. Il primo, è quello di delineare la migliore attitudine verso uno o l’altro radicale espressa dalla matrice PQ ed estrapolare come secondo aspetto, quale tra i due idrogel PC e PQ si presta di più a svolgere un’attività preservante; affinché PQ possa inibire del 50% il radicale DPPH occorre una concentrazione di 15 mg/ml, il valore massimo di inibizione invece, si attesta intorno al 68%

75% come nel caso della matrice PC. Per il saggio con l’ABTS il discorso varia, innanzitutto si raggiunge lo stesso valore di inibizione percentuale massima che si ha con PC ma, a concentrazioni nettamente superiori rispetto a quelle utilizzate per l’idrogel contenente CT, infatti, occorre una concentrazione pari a 75 mg/ml affinché l’inibizione sia costante, lo stesso discorso vale per avere un’inibizione del 50%, dove serve una concentrazione di 25 mg/ml contro i 10 mg/ml di PC. Paragonando i due risultati, anche in questo caso, si ha una maggiore attività inibente nei confronti di uno o l’altro radicale, sebbene per PQ sembrerebbe quasi paritaria. In realtà se da un lato occorre una quantità minore di matrice per inibire del 50% il DPPH rispetto a quella richiesta per inibire del 50% l’ABTS, il valore di massima inibizione non va oltre il 68%, al contrario per inibire l’ABTS serve una quantità di poco superiore a quella richiesta per avere lo stesso effetto nel DPPH, ma in questo caso, il valore massimo inibente si attesta a quello registrato per PC seppur a minore concentrazione.

In conclusione, dai dati raccolti, entrambi gli idrogel PC e PQ nel saggio con il radicale cationico ABTS sono efficaci, ma la migliore efficienza è attribuibile a PC per le minori quantità di polimero richieste; nell’inibizione del radicale DPPH, PC sembrerebbe sia efficace che efficiente poiché inibisce con concentrazioni minori il radicale e a valori percentuali maggiori rispetto a quelle richieste da PQ.