Parte sperimentale 1 Material

N-isopropilacrilammide, N-N’ etilenbisacrilammide, Naprossene, Diclofenac sodico, acido acetico glaciale, ammonio acetato sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co, Milano, Italia). Irgacure 2959 (1-[4-(2-idrossietossi)-fenil]-2-idrossi-2-metil-1-propan-1- one, con un massimo di aasorbimento a 275 nm, acquistato da Ciba) è stato utilizzato come fotoiniziatore. Acetonitrile, etanolo, metanolo e acqua, tutti HPLC-grade, sono stati acquistati dalla Carlo Erba Reagenti (Milano, Italia).

2.7.2 Strumentazione

Gli spettri FT-IR sono stati effettuati su pasticche di KBr, utilizzando uno spettofotometro Jasco FT-IR 4200 nel range di lunghezza d’onda 4000-400 cm-1. Il segnale è stato ottenuto eseguendo 100 scan a una risoluzione di 1 cm-1. Gli studi morfologici (superficie e sezione dei film polimerici) sono stati eseguiti tramite un microscopio a scansione elettronica Leica LEO 420; la superficie dei campioni è stata resa conduttrice mediante la deposizione di uno strato di oro (spessore ~100Å), effettuato sotto atmosfera di argon. Per analizzare la sezione i campioni sono stati crio-fratturati dopo immersione in azoto liquido. Le analisi calorimetriche sono state effettuate utilizzando un calorimetro a scansione differenziale Netzsch DSC 200 PC riscaldando circa 10 mg di campione rigonfiato (48 h in acqua fino al raggiungimento del massimo swelling) da 25 a 55°C sotto azoto con una velocità di flusso pari a 25 ml·min-1 e un riscaldamento di 3°C al minuto.

2.7.3 Sintesi dei copolimeri

Per la sintesi dei copolimeri, NIPAAm e EBA nell’opportuno rapporto stechiometrico sono disciolti in acqua bidistillata, e al fine di facilitare la solubilizzazione dei monomeri la soluzione è stata sottoposta a sonicazione (3x15 min). A solubilizzazione avvenuta alla soluzione è stato aggiunto l’Irgacure 2959 all’1% m/m rispetto alla carica monometrica. Per la reazione di polimerizzazione due lastre di vetro (10x10 cm) sono state assemblate tramite clips interponendo tra i due uno spaziatore di Teflon dell’opportuno spessore (0,8 e 1,6 mm). La soluzione precedentemente preparata è stata degassata sotto flusso di azoto per 20 minuti e trasferita poi, tra i piatti di vetro assemblati per essere sottoposta a polimerizzazione UV (Philips HPK 125, 500 mW cm−2,  = 275 nm, t = 10 min). I polimeri infine, sono stati lavati per 24-48 h con acqua distillata per allontanare le specie non reagite ed essiccati sotto vuoto in presenza di P2O5.

2.7.4 Studi di rigonfiamento

Un’attenta analisi della struttura reticolata degli idrogel preparati è stata eseguita tramite il metodo di Peppas e Meadows precedentemente descritto. Campioni di approssimativamente 1 cm2 sono stati tagliati da ogni film polimerico ottenuto, e pesati in aria e in un non solvente (n-eptano). I campioni sono stati quindi posizionati in una soluzione di tampone fosfato (pH = 7,0) per 24h a 25°C, utilizzando un bagno termostatato, fino al raggiungimento dell’equilibrio, e di nuovo pesati in aria e in n-eptano. La temperatura del bagno termostatato

è stata quindi portata a 40°C per altre 24h, trascorse le quali i copolimeri sono stati nuovamente pesati in aria e n-eptano.

2.7.5 Caricamento del farmaco mediante incorporazione

Mediante la tecnica di incorporazione, i farmaci (Naproxene e Diclofenac sodico) sono stati caricati nella matrice polimerica durante il processo di polimerizzazione. In particolare, un opportuno volume di soluzione del farmaco è stato aggiunto alla miscela di polimerizzazione in modo da assicurare una percentuale di impregnazione del 10% m/m. Il film ottenuto lavato con aliquote di acqua al fine di allontanare le specie monomeriche non reagite e l’iniziatore è stato lasciato poi essiccare sotto cappa per 48 h: per i polimeri caricati con Naprossene è stato utilizzata come soluzione di lavaggio acqua acida (soluzione al 5% v/v di acido acetico glaciale), mentre per il Diclofenac sodico, etanolo assoluto.

La determinazione della quantità di farmaco intrappolata è stata eseguita sottoponendo la matrice caricata di farmaco (circa 100 mg) a processo estrattivo tramite soxhlet utilizzando come solvente di estrazione 200 ml di una miscela 3/7 v/v metanolo/acqua per 48h e quindi 200 ml di etanolo per altre 48h. I solventi di estrazione sono stati analizzati tramite analisi HPLC al fine di determinare la concentrazione di ciascun farmaco e quindi la percentuale di principio attivo caricato dalle matrici.

2.7.6 Caricamento del farmaco mediante impregnazione

Il caricamento del farmaco è stato effettuato anche tramite impregnazione. Una quantità nota di matrice (circa 200 mg) è stata messa a contatto con un piccolo volume (2,0 ml) di una soluzione a concentrazione nota di farmaco (10,0 mg/ml). L’impregnazione è stata condotta a temperatura ambiente sotto agitazione per tre giorni, durante i quali il farmaco a contatto con la superficie esterna delle microsfere stabilisce delle interazioni deboli con la matrice prevalentemente a livello superficiale. Successivamente, il solvente è stato rimosso per filtrazione e i film polimerici sono stati essiccati a 40°C sotto vuoto fino a peso costante.

2.7.7 Stabilità dei principi attivi a pH 7.0 a 25 e 40°C

La stabilità dei farmaci è stata studiata a pH 7,0 e a differenti temperature (25 e 40°C. 10 mg di principio attivo sono stati incubati a 25 e 40°C in tampone fosfato 10-3 M a pH 7,0. A determinati intervalli di tempo, corrispondenti agli stessi tempi degli esperimenti di rilascio, i campioni sono stati analizzati tramite analisi HPLC. Le analisi HPLC sono state condotte

20 l), un detector Jasco UV-2075 e un integratore Jasco-Borwin. Per ottenere la separazione cromatografica è stata utilizzata a temperatura ambiente una colonna C18 a fase inversa

(μBondapak, 150×4.6 mm, diametro interno pari a 10 μm acquistata dalla Waters) Le condizioni cromatografiche per i due farmaci sono:

 Naprossene: la fase mobile è acetonitrile/tampone fosfato 5 mM, pH 6,8 (5/5, v/v), la velocità di flusso è di 0,5 ml min-1, lo spettrofotometro UV è settato a 280 nm (Venkateswara Rao et al., 2014). Tempo di ritenzione di 4,5 min, limite di rilevamento 0,6 M, limite di quantificazione 12,1 M.

 Diclofenac sodico: la fase mobile è ammonio acetato/metanolo/acetonitrile (4/3/3, v/v). Il pH della porzione acquosa della fase mobile è stato aggiustato con acido acetico glaciale, la velocità di flusso è 0,6 ml min-1, lo spettrofotometro UV è stato settato a 284 nm (Altimari et al., 2012). Tempo di ritenzione di 4,5 min, limite di rilevamento 0,6 M, limite di quantificazione 14 M.

2.7.8 Rilascio dei farmaci dal film polimerico

Gli studi di rilascio sono stati condotti usando il metodo di dissoluzione descritto nella USP XXIV a temperature inferiore (25°C) e superiore (40°C) al valore della LCST di ciascun polimero. Quantità note (circa 10 mg) di ogni matrice impregnata o incorporata sono state poste in 10 ml del mezzo di rilascio costituito da una soluzione acquosa (PBS, pH 7,0, 10-3 M) alle temperature di 25°C e 40°C. Ad intervalli di tempo prestabili è stata prelevata una quantità del mezzo di rilascio (1,0 ml) che è stata analizzata mediante HPLC per calcolare la quantità di principio attivo presente, mentre altri 2,0 ml sono stati inseriti nel mezzo di rilascio per mantenere costante il volume. Le condizioni HPLC per ciascun principio attivo sono riportate nel precedente paragrafo.

I profili di rilascio pulsato sono stati ottenuti immergendo i polimeri caricati in tampone fosfato a pH 7,0 (10 ml, 10-3 M) e alternando la temperatura a intervalli di tempo stabiliti, tra 25 e 40°C. Gli esperimenti di rilascio sono stati eseguiti stabilizzando gli idrogel a due differenti temperature iniziali in assenza di mezzo di rilascio. I campioni, a intervalli di tempo stabiliti, sono stati filtrati (Iso-Disc™ Filters PTFE 25-4 25 mm x 0.45 m, Supelco) e analizzati tramite HPLC.

2.7.9 Analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato, ed i risultati sono stati in accordo entro ± 5%, che è il margine di errore standard.

CAPITOLO 3

Preparazione di un dispositivo elettro-modulabile