L'iperglicemia induce la sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dai mitocondri che possono causare l'insorgenza e la progressione del diabete e delle sue complicanze (114), e l'aumento dello stress ossidativo può causare danno mitocondriale e stimolare la biogenesi mitocondriale(115). E’ stato osservato un notevole aumento del contenuto di mtDNA nei leucociti del sangue periferico nei pazienti con disregolazione del glucosio, ed una sua correlazione con la sostanza reattiva all'acido tiobarbiturico (TBARS) nel sangue (116). Al contrario, ci sono state segnalazioni di diminuzione del numero di copie di mtDNA nel muscolo scheletrico di pazienti con diabete di tipo 2 (DM2)(117) e della loro prole insulino-resistente(113). Il ROS può esercitare un duplice effetto sulle cellule, e una volta che supera la soglia di capacità di riparazione cellulare, può causare danni ossidativi al mtDNA
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e indurre apoptosi in diversi tessuti (118). Al fine di indagare la possibilità che l’iperglicemia possa avere influenze specifiche sul contenuto di mtDNA, un recente studio ha confrontato simultaneamente il contenuto di mtDNA di soggetti con diabete di tipo 2 e di controlli, nei campioni del muscolo della gamba, del tessuto dei vasi sanguigni, e dei leucociti periferici. Nei campioni di muscolo di entrambi i gruppi, sono stati anche analizzati lo stress ossidativo, la biogenesi mitocondriale ed i
cambiamenti apoptotici. Tramite immunoistochimica della 8-
idrossideossiguanosina (8-OHdG) sono stati misurati, negli stessi tessuti, i livelli del marcatore di stress ossidativo. I campioni di siero sono stati analizzati per la perossidazione lipidica, per la sostanza reagente all'acido tiobarbiturico (TBARS), e per i tioli liberi totali. I tessuti muscolari sono stati esaminati in rapporto all'espressione di PGC1α, a Tfam e all'apoptosi.
Differenze tissutali nel contenuto di mtDNA
Il numero di copie di mtDNA era più alto nei muscoli, seguito dal vasi sanguigni e più basso nei leucociti sia nei pazienti diabetici tipo 2 (2.86±0.33 vs 2.57±0.14 vs 2.25±0.26, P<0.001) che nei soggetti di controllo (3.20±0.14 vs 2.72±0.19 vs 1.98±0.06, P = 0.002).
Differenze di gruppo nel contenuto tissutale di mtDNA
I pazienti con diabete di tipo 2 avevano meno contenuto di mtDNA rispetto ai controlli nei tessuti muscolari (2,86±0,33 vs 3,20±0,14, P= 0,025), ma più contenuto di mtDNA nei leucociti (2.25±0.26 vs 1.98±0.06, P=0.037), dopo l'aggiustamento per età, sesso e indice di massa corporea (Tabella 1). Il contenuto di mtDNA nei tessuti dei vasi sanguigni non era statisticamente differente tra i due gruppi (2.57±0.14 vs 2.72±0.19, P = 0,053). Utilizzando l'emoglobina glicosilata (HbA1c)
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come misura di iperglicemia cronica, è stato trovato che il livello di HbA1c è significativamente e negativamente correlato con il contenuto mtDNA nel tessuto muscolare nei pazienti con diabete tipo 2 (r =-0,808, P <0.001), ma positivamente e non significativamente correlato al contenuto di mtDNA (r = 0.394, P = 0,117) nei leucociti.
Differenze di gruppo nello stress ossidativo
I pazienti diabetici hanno mostrato un numero significativamente maggiore di cellule muscolari e cellule dei vasi sanguigni positive per l’ immunoistochimica di 8 OHdG rispetto ai controlli (63,2±16,2% vs. 19,1± 11,4%, P<0,001; 64,7±21,5% vs 26,9±17,7%, P = 0,01). Non ci sono state significative differenze di TBARS tra i sieri dei pazienti e quelli dei controlli (0.88±0.41 vs 1.61±0.65, P = 0.10) o della totalità di tioli ridotti (1.04±0.33 vs 1.56±0.62, P = 0.09) dopo aggiustamento per età, sesso e BMI.
Contenuto di mtDNA nel tessuto muscolare e stress ossidativo
Nel gruppo diabetico, il contenuto di mtDNA nel tessuto muscolare era significativamente correlato con l'indice di marcatura dei livelli di 8- OHdG nel tessuto muscolare (r = 0,75, p = 0,02), ma non con i livelli sierici di TBARS (r =-0,37, P = 0.20) o di tioli totali ridotti(r =-0,02, P = 0,95). Anche nel gruppo dei non-diabetici, il contenuto di mtDNA nel tessuto muscolare è stato correlato con l'indice di marcatura dei livelli di 8-OHdG (r = 0.91, P = 0.012), ma non con i livelli sierici del TBARS (r =-0,11, P = 0.88) o con i livelli di tioli (r =-0,58, P= 0.41).
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Tabella 1 Le caratteristiche dei soggetti nel gruppo di controllo e nel gruppo dei diabetici
Tessuto muscolare: PGC1-a, gli indici di marcaura Tfam, e TUNEL La figura 6 riassume l'espressione di marcatori della biogenesi mitocondriale, PGC1α e Tfam, e l'indice TUNEL del cambiamento apoptotico. L'indice di marcatura TUNEL in pazienti diabetici tipo 2 è stato significativamente maggiore a quello trovato nei soggetti non- diabetici (48,0±29,3% vs 14,2±12,4%, P = 0.013). Anche se gli indici di etichettatura di PGC1α e Tfam erano maggiori nel gruppo di diabetici non erano comunque significativamente diversi (PGC1-α vs 27,5 ± 15,5% 15,9 ± 5,3%, P = 0,09; Tfam 15,4 ± 15,5% vs 9.6±4,6%, P=0.38).
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Figura 6 Confronto tra TUNEL, PGC1α e indici di etichettatura Tfam nel tessuto muscolare di pazienti e gruppo di controllo
Quindi questo studio ha trovato che esiste una risposta tessuto-specifica all’ iperglicemia in pazienti con diabete di tipo 2. Mentre questi pazienti avevano un contenuto più basso di mtDNA nei tessuti dei muscoli, avevano un contenuto di mtDNA più alto dei leucociti rispetto ai controlli non diabetici. Sia nel gruppo di controllo che tra i diabetici, c'era una correlazione positiva tra il contenuto di mtDNA e 8-OHdG nel tessuto muscolare, sebbene i livelli fossero significativamente differenti tra i due gruppi. In uno studio precedente era stato riscontrato un progressivo aumento del numero di copie di mtDNA nei leucociti nella progressiva disregolazione del metabolismo del glucosio, e che l'iperglicemia ma non l’ insulino-resistenza (IR), era correlata all’ aumento del numero di copie di mtDNA nei leucociti(116). Relativamente al tessuto muscolare, Petersen et al. hanno dimostrato che la prole insulino-resistente di genitori con diabete di tipo 2 hanno un'alterata funzione mitocondriale associata all'insulino-resistenza muscolare(106) ed in uno studio di follow-up, hanno trovato che la riduzione dell'attività mitocondriale nei soggetti insulino-resistenti potrebbe essere attribuita ad una riduzione del contenuto mitocondriale nel tessuto muscolare(113). Nei pazienti con diabete di tipo 2 a livello dei tessuti bersaglio dell’insulino
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resistenza quali il muscolo scheletrico (117) e il tessuto adiposo(119), è stato infatti riscontrato un minor numero di copie di mtDNA. Inoltre, poiché al contrario delle cellule muscolari scheletriche che replicano lentamente, i leucociti replicano rapidamente, la discrepanza nell'effetto del metabolismo del glucosio sul numero di copie del mtDNA può essere attribuita alla natura dei due tipi cellulari. In entrambi gli studi è stato osservato(116), che l'indice di marcatura dei livelli di 8-OHdG nel tessuto muscolare e i livelli di TBARS nel siero erano superiori nei pazienti diabetici rispetto a quelli dei controlli non diabetici. Il contenuto di mtDNA periferico nei leucociti era positivamente correlato ai livelli di TBARS nel siero(116), mentre il contenuto di mtDNA muscolare era positivamente correlato ai livelli di 8-OHdG nel muscolo, ma non con i livelli di TBARS nel siero. L’aumento dello stress ossidativo può causare danno mitocondriale e stimolare la biogenesi mitocondriale, forse come risposta compensatoria ai mitocondri difettosi, con la catena respiratoria compromessa o con mtDNA mutato(115,117). Wei et al. hanno dimostrato che H2O2 ed il trattamento sulfoximina butionina della linea
cellulare di fibroblasti umani per 24-72 h ha aumentato la massa mitocondriale ed il contenuto di mtDNA in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo(115). Al contrario, quando si trattano in coltura miociti ventricolari di ratti neonati con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) per 1 h, il TNF-α ha provocato l’aumento della produzione di ROS e diminuito il numero di copie di mtDNA(120). Una possibile spiegazione per la differenza nei risultati può essere che il ROS ha un duplice effetto sulle cellule. A un certo livello, il ROS può indurre una risposta allo stress alterando l'espressione di geni nucleari specifici per sostenere il metabolismo energetico e salvare la cellula. Tuttavia, una volta che passa una certa soglia, ROS può causare danni ossidativi al mtDNA e ad altri componenti delle cellule colpite provocano
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l'apoptosi(118). L'esposizione a lungo termine allo stress ossidativo può causare più danni al DNA a causa dell’ accumulo nelle cellule post- mitotiche (muscolari) piuttosto che nelle cellule mitotiche (leucociti). In questo studio è stato dimostrato che il contenuto di mtDNA era positivamente correlato con i livelli di 8-OHdG nel muscolo in soggetti diabetici e di controllo, suggerendo che lo stress ossidativo stimola la biogenesi mitocondriale in entrambi i gruppi. I possibili meccanismi che nei diabetici causano la diminuzione del contenuto di mtDNA nel tessuto muscolare sono la minor stimolazione della biogenesi mitocondriale in risposta allo stress ossidativo e/o l’ induzione dell’apoptosi . Nei risultati non è stato riscontrato l’aumento dell’espressione di PGC1α e Tfam, neanche significativo, nel tessuto muscolare del gruppo dei diabetici rispetto ai controlli. PGC1α è un importante regolatore della biogenesi mitocondriale e Tfam è un fattore di trascrizione mitocondriale che agisce sui promotori all'interno del D-loop per regolare la replicazione del mtDNA(121). Pertanto, questi dati suggeriscono che la diminuzione della biogenesi mitocondriale non può giocare il ruolo principale in questo evento. La diminuzione tessuto-specifica del contenuto di mtDNA può essere principalmente dovuta alla maggiore apoptosi indotta dallo stress ossidativo accumulato nel tessuto muscolare dei diabetici, che ha superato la soglia di salvataggio cellulare. In conclusione, i dati suggeriscono che l'impatto dell'iperglicemia sul contenuto di mtDNA nei leucociti che replicano rapidamente è diverso da quello sul muscolo scheletrico che replica lentamente. Il duplice effetto di ROS, stimolare la biogenesi mitocondriale e suscitare l'apoptosi, può contribuire alla differenza del contenuto di mtDNA nei diversi tessuti.
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L’IMPORTANZA DELLA RISPOSTA ALLO STRESS