COATTIVATORE 1 DEL PROLIFERATORE γ DEL
PEROSSISOMA (PGC1α)
Il bilancio energetico gioca un ruolo chiave nello sviluppo di T2D; BMI, l'alto indice di massa corporea, che riflette un bilancio energetico positivo(159) è stato positivamente associato all’insorgenza di diabete di tipo 2 e l'elevata attività fisica, un altro componente dell'equazione del bilancio energetico, è stata associata a una minore incidenza di diabete di tipo 2(160). Pertanto, è probabile che l’insorgenza del diabete mellito 2 sia associata ai geni che codificano i regolatori trascrizionali che influenzano il bilancio energetico. I PPAR sono una famiglia di fattori di trascrizione che regolano il bilancio energetico attraverso la promozione della deposizione o della dissipazione di energia(161). La famiglia delle proteine PGC1 è stata indicata come un importante regolatore della gluconeogenesi, degli acidi grassi e della termogenesi adattiva(63) . I geni PPARGC codificano per tali proteine; giocano un ruolo critico nel mantenimento di glucosio, lipidi, e omeostasi energetica e sono probabilmente coinvolti nelle condizioni patologiche quali obesità e
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diabete(161). L’espressione di questi geni può influenzare la sensibilità all'insulina, nonché il dispendio energetico, contribuendo in tal modo allo sviluppo dell’ obesità(161)
. PGC1A è implicato nell’ ossidazione degli acidi grassi attraverso l'aumento della capacità e della funzione mitocondriale, rendendo questo cofattore un candidato chiave per il trattamento della lipotossicità(162). L’espressione ectopica di PGC1A nelle cellule adipose bianche conferisce loro alcune delle proprietà del grasso bruno, compresa l'induzione di proteina di disaccoppiamento, un disaccoppiatore mitocondriale e dissipatore di calore. Quindi è diventato chiaro che PGC1A può coattivare un vasto repertorio di fattori di trascrizione, tra cui la maggior parte dei membri della famiglia dei recettori nucleari(159). E' stato riportato che la variazione di PGC1B può contribuire alla patogenesi dell'obesità(163). Per verificare la correlazione tra patogenesi del DM2 e regolazione trascrizionale dei geni coinvolti nel bilancio energetico, sono state valutate le associazioni di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in cinque geni delle famiglie di PPAR e PGC1 (PPARA, PPARG, PPARD, PPARGC1A, e PPARGC1B) in pazienti con diabete di tipo 2, e le loro interazioni con BMI ed esercizio fisico in uno studio di associazione in due fasi. Le due famiglie sono state studiate per l’ impatto che esercitano sul bilancio energetico e per il plausibile ruolo che svolgono nello sviluppo dell’ insulino resistenza. Nella fase I dello studio sono stati usati i dati derivanti da uno studio di associazione dell’ intero genoma (GWAS) di Shanghai( 1019 casi T2D e 1709 controlli) e da una meta analisi dei dati provenienti dalla Asiatic genetic Epidemiology Network per T2D (AGEN-T2D). Nella fase II sono stati valutati 9 polimorfismi a singolo nucleotide nella famiglia PGC1 su un gruppo indipendente di uomini e donne di mezza età di Shangai (1700 casi di TD2 e 1647 controlli). Un solo SNP in PPARC1B, rs251464, è stato replicato in fase II e le interazioni gene-
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BMI, gene-esercizio e T2D sono state valutate tramite dati combinati provenienti da Shanghai GWAS e dalla fase II su 2719 casi e 3356 controlli. Nessun SNP nella famiglia del gene PPAR è stato associato con diabete tipo 2 in fase I. Alcuni studi hanno collegato PPARA ai componenti della sindrome metabolica e al diabete di tipo 2 nelle popolazioni caucasiche(164). Uno studio cross-sezionale ha riportato un'associazione di un aplotipo di PPARA con l'età nella diagnosi di diabete di tipo 2 tra i soggetti europei(165). La variazione genetica nel gene PPARD è stata associata a concentrazioni di glucosio a digiuno superiori(166) ma non è stata trovata nessuna associazione tra questo gene e T2D nella popolazione coreana e nella popolazione cinese(167). Tuttavia, in uno studio condotto tra i cinesi Han, uno SNP, rs6902123, in PPARD è stato significativamente associato al diabete tipo 2 e ad un’ alterata glicemia a digiuno(168). Il gene PPARG è stato associato ad una maggiore predisposizione all'obesità e alla sensibilità all'insulina(169) e l'allele Ala del polimorfismo P12A in PPARG è stato associato a diabete tipo 2 in un GWAS(170) ed è stato replicato in molti studi, ma questo non ha trovato alcuna associazione tra detto polimorfismo e T2D. Dei nove SNP nella famiglia di geni PPARGC associati al diabete di tipo 2 in fase I, solo uno SNP in PPARGC1B, rs251464, è stato replicato in fase II. In uno studio condotto in una popolazione cinese Han, non è stata trovata nessuna associazione tra sei SNPs di geni PPARGC1A e T2D, mentre un aplotipo comune di PPARGC1A è stato associato ad alto rischio diabete tipo 2(171). Due SNP comuni al gene PPARGB1A (Gly482Ser e Thr394Thr) sono stati precedentemente associati al diabete di tipo 2, ma questo non risulta da questo studio. Infatti nella popolazione esaminata, questi due SNP non erano in disequilibrio di associazione con gli SNP che sono stati valutati nello studio per la replica. In alcuni studi SNP Gly482Ser in PPARGC1A è stato associato all'insulino-resistenza e alla
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suscettibilità a T2D(172). Una meta-analisi di otto studi, di cui cinque su popolazioni europee, su una popolazione Pima indiana, e su una popolazione giapponese, ha suggerito che la variante Gly482Ser di PPARGC1A è associata al rischio di diabete tipo 2(173). L'altro SNP di PPARGC1A, Thr394Thr, è stato associato al grasso corporeo e al diabete di tipo 2 nelle popolazioni asiatiche del sud dell'India(174). L'espressione di entrambi i coattivatori PPARGC1A e PGC1B è risultata inferiore sia nei soggetti diabetici che nei non diabetici messicani con storia familiare positiva a dimostrazione del fatto che questi geni hanno un potenziale ruolo nell'eziologia del T2D(38). Associazioni genetiche di PPARGC1B con diabete tipo 2 sono state esaminate in una popolazione coreana di 775 pazienti T2D e 316 controlli(175), ma i risultati non sono stati significativi. In questo studio, sono state studiate le possibili interazioni tra SNPs in questi due geni e BMI ed esercizio fisico, i componenti principali del bilancio energetico. L’espressione del gene PPARGC1A può influenzare la sensibilità all'insulina nonché il dispendio energetico, contribuendo in tal modo allo sviluppo dell’ obesità umana(160). Punti di forza di questo studio comprendono le sue relativamente grandi dimensioni, e il disegno a due stadi, che ha permesso una valutazione indipendente dei risultati della fase I. Inoltre sono state fornite informazioni dettagliate sulla partecipazione dell’ esercizio e le misure di BMI, che hanno permesso di proseguire le indagini sulle interazioni gene -esercizio e gene-BMI. Un limite dello studio è che è stato eseguito un numero relativamente elevato di test, aspetto che può aver aumentato il numero di errori di tipo I. Tuttavia, lo studio è un'ipotesi guidata ed è basato sui risultati di altri studi spesso basati su analisi GWAS. L'età era disponibile solo in SBCS / SWHS GWAS, ma non in tutti gli studi di AGEN-T2D e confrontando i risultati di questo studio con i risultati della meta-analisi, sono stati regolati solo
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per BMI nel SBCS / SWHS GWAS. In sintesi, la variazione nel gene PPARGC1B può essere associata con DT2 tra uomini e donne cinesi di mezza età. I dati non suggeriscono interazioni tra questo gene e BMI o partecipazione all’ esercizio.
REGOLAZIONE EPIGENETICA DI PGC1α NEL DIABETE DI TIPO 2
L’epigenetica si riferisce ai cambiamenti che influenzano il fenotipo senza alterare il genotipo, quindi le modificazioni ereditabili che variano l’espressione genica pur non alterando la sequenza di DNA. Un segnale epigenetico è un qualsiasi cambiamento ereditabile che non altera la sequenza nucleotidica di un gene ma la sua attività. Queste mutazioni dette epimutazioni sono fattori non genomici che provocano una diversa espressione dei geni dell’organismo, durano per tutta la vita e possono trasmettersi alle generazioni successive attraverso le divisioni cellulari senza che le corrispondenti sequenze di DNA risultino mutate. Stile di vita, dieta ed esercizio fisico hanno un ruolo chiave nella comparsa di tali mutazioni. L’attività di PGC1α è controllata da modificazioni post translazionali, che potrebbero conferirle specificità verso geni target, come foforilazione(176), acetilazione(177), deacetilazione(178), metilazione(179), sumoilazione(180). La deacetilazione e la metilazione aumentano l’attività della PGC1α; l’acetilazione e la sumoilazione la influenzano negativamente mentre la fosforilazione può avere effetti positivi o negativi in base alla fosforilazione delle chinasi. La fosforilazione mediata dalle citochine, in particolare dalla p38 MAPK aumenta l’espressione di UCP3(181)
, mentre la fosforilazione mediata dalla S6 chinasi diminuisce la capacità di PGC1α di regolare l’espressione dei geni mitocondriali(176)
. Quindi si può affermare che tali modificazioni post translazionali siano importanti modulatori dell’
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attività di PGC1α. Le modificazioni epigenetiche come la metilazione del DNA e la modificazione degli istoni sono eventi chiave per il normale sviluppo umano(182). L'espressione del mRNA del PPARGC1A viene ridotta negli isolotti pancreatici di pazienti con diabete 2 ed è influenzata sia da fattore genetici che epigenetici. La modifica epigenetica, risulta come un doppio aumento nella metilazione del DNA del promotore PGC1A del diabete. Questo doppio aumento della metilazione del DNA è dovuto all'enzima metil transferasi 1 del DNA (DNMT1). In un recente studio, l'attività della metilazione dell'enzima DNMT 1 è stata inibita con idonei inibitori della metilazione che hanno portato alla diminuzione della metilazione della proteina PGC 1α. Lo studio dell'interazione di DNMT1 modificato con PGC 1α conduce ad una nuova scoperta farmacologica nel trattamento del diabete di tipo 2. Il diabete di tipo 2 (DM2) è caratterizzato da iperglicemia cronica come risultato di funzioni cellulari β pancreatiche deteriorate e della resistenza all'insulina nei tessuti periferici (muscolo scheletrico, tessuto adiposo e fegato). PGC1α (gene PPARGC1A) è un fattore importante che regola l'espressione dei geni per la fosforilazione ossidativa e la produzione di ATP nei tessuti bersaglio attraverso la coattivazione dei recettori nucleari(184). È stato precedentemente dimostrato che l'espressione di PPARGC1A e una serie di geni coinvolti nella fosforilazione ossidativa sono stati ridotti nel muscolo scheletrico di pazienti con diabete di tipo 2. Inoltre, un polimorfismo comune, Gly482Ser, nel gene PPARGC1A è stato associato ad un aumentato rischio di diabete di tipo 2 e ad una riduzione correlata all'età dell'espressione del PPARGC1A nel muscolo(185). L'obesità, l'attività fisica ridotta e l'invecchiamento sono fattori di rischio ben noti per il diabete di tipo 2(186). Tuttavia, non tutti gli individui esposti ad un ambiente ricco sviluppano la malattia. Una ragione probabile è che la variazione genetica modifica la suscettibilità
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individuale all'ambiente. Tuttavia, l'ambiente potrebbe anche modificare i fattori di rischio genetici influenzando l'espressione di un gene dalla metilazione del DNA o modificazioni degli istoni.
Analisi di metilazione del DNA
La metilazione del DNA comporta l’aggiunta di un gruppo metilico alla posizione 5 dell'anello pirimidinico della citosina o in posizione 6 sull’ azoto dell'anello purinico della adenina. Il processo avviene nelle cosiddette isole CpG, situate nel promotore dei geni eucariotici. Per dimostrare se la metilazione del DNA influenza l'espressione genica nei tessuti bersaglio del diabete di tipo 2 (T2DM) e quindi la patogenesi della malattia(187) è stato utilizzato un metodo di sequenziamento con bisolfito per determinare il pattern di metilazione. Il trattamento del DNA con bisolfito converte i residui di citosina in uracile, ma lascia i residui di 5-metilcitosina inalterati introducendo quindi cambiamenti specifici nella sequenza di DNA ,che dipendono solo dallo stato di metilazione dei residui di citosina, e cedendo ad ogni nucleotide informazioni riguardanti lo stato della metilazione di un segmento di DNA. Per recuperare queste informazioni(188) possono poi essere eseguite varie analisi sulla sequenza alterata. Il software Meth Primer ha permesso di identificare i siti CpG. Dall’ osservazione dei risultati riportati in figura 7 si è visto che le sequenze originali nella prima riga, le sequenze bisolfato nella riga successiva e i siti CpG sono contrassegnati da ++; il residuo di citosina non metilata è stato convertito in uracile mentre la citosina metilata è rimasta inalterata. Da queste osservazioni si è potuto risalire all’identificazione delle molecole metilate e non metilate.
Inibizione dell’attività di metilazione del DNA da parte della metile transferasi 1 (DNMT1)
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Il motivo per cui è stata eseguita l'inibizione della DNMT1 è che è responsabile dell' iper metilazione di PGC1α, attraverso il trasferimento di un gruppo metilico sul residuo di citosina. Questo sembra essere un fattore implicato nella patogenesi del diabete di tipo 2. Inibendo l’attività di metilazione di DNMT1, si verifica di conseguenza l’inibizione dell’ipermetilazione del DNA. L’ inibizione della attività di metilazione di DNMT1 è stata eseguita con metodi di interazione, che hanno appunto lo scopo di modificare la struttura o la funzione della proteina. Composti selezionati per l'inibizione della DNMT1 sono: analoghi di azacitidina; analoghi della idralazina; analoghi delle decitabine; analoghi della procainamide e analoghi delle zebularine.
Interazione proteina-proteina
L’interazione macromolecolare è il modellamento computazionale della struttura quaternaria di complessi formati da due o più macromolecole biologiche interagenti. I complessi proteina-proteina sono i targets più comunemente usati per tale modellamento. Quindi l’interazione proteina-proteina ha l'effetto di modificare la funzione, la struttura della proteina o alcune delle sue proprietà. Sulla base di questa tecnica la proteina DNMT1 ancorata viene nuovamente agganciata alla proteina PGC1α modificando così il suo processo di ipermetilazione(189). La selezione delle proteine per lo studio di aggancio si è basata sul alcuni fattori; tali proteine dovrebbero contenere un ligando di co-cristallo, la loro struttura dovrebbe essere determinata con diffrazione dei raggi X e la risoluzione dovrebbe essere un valore tra 2,0-2,5 Angstrom. Tra le 10 voci di DNMT1, 3PT9 è stata presa per le analisi di aggancio (in base alle statistiche di Ramachandran plot) poichè ha mostrato 620 regioni tra le più favorite e inoltre 83 nelle regioni “allowed” e nessun residuo nelle regioni “not allowed”. Sulla base dei risultati di aggancio che si basano
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sul punteggio e sull'interazione dell’aggancio stesso, è stata scoperta la miglior molecola inibitrice. Le molecole di ligando interagiscono con i residui del sito attivo che ha la regione di legame come nel dominio di legame della metiltransferasi. Questo dominio catalizza la reazione di metilazione della citosina del DNA in posizione 5 che produce metilcitosina C5. Quindi, l'inibizione di DNMT1 ha la capacità di diminuire l'ipermetilazione delle proteine. La proteina DNMT1 attraccata può inibire la proprietà di metilazione del PGC1α. L’ interazione proteina-proteina è stato eseguita tra DNMT1 ancorata e la proteina PGC1α, che ha interazioni con ARG1187, ARG1181, VAL1189, GLN1212, SER 1149, e SER 225, PHE 226, THR 229, GLY 258, ARG 280, e ha gli stessi residui del sito attivo di DNMT1 inibita (figura 8). Quindi, possiamo dire chiaramente che la probabilità di inibire l'attività della proteina PGC1α è maggiore nell’interazione proteina-proteina. Questo approccio viene utilizzato per trovare nuove strade da intraprendere per la scoperta di nuovi farmaci da impiegare nel trattamento del diabete di tipo 2.
80 Figura 7 Meth Primer output
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Figura 8 DNMT1 modificata agganciata a PGC1α. Le due proteine hanno interazioni con i residui di ARG 1187, ARG 1181, VAL 7189, GLN 1212, SER A1149, SER 215, PHE 226, THR 229, GLY 258, ARG 280. Color magenta: DNMT1 rosso: PGC1α. Le molecole ligando sono in interazione con i residui del sito attivo che ha la regione di legame come nel dominio di legame di DNMT1.
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PGC1α: DA SOSTENITORE DELLA FUNZIONE
MITOCONDRIALE A CANDIDATO ECCELLENTE DELLA