Dai primi studi sulla risonanza nelle singole cellule componenti lo strato granulare cerebellare del ratto, cellule granulari e cellule del Golgi, è emerso un aspetto importante ossia la presenza di due elementi a livello cellulare in grado di originare il fenomeno di risonanza: la corrente KM che funziona come “risuonatore”, elemento in grado di generare una migliore risposta della cellula a determinate frequenze (frequenze in banda θ) e la corrente Nap (corrente sodio persistente) definita “amplificatore”, elemento in
grado di amplificare la risposta generata dalla corrente KM (D’Angelo et al., 2001; Solinas et al., 2007).
La necessità di confermare la persistenza di questo fenomeno a livello circuitale, ha portato alla inclusione dei singoli modelli di cellula Grc e Goc (D’Angelo et al., 2001; Solinas et al., 2007b) in un circuito elementare, verificando la presenza di questi due meccanismi cellulari, importanti per la generazione della risonanza nei singoli neuroni, anche nel circuito.
In questo lavoro di tesi abbiamo sviluppato un prototipo della rete dello strato granulare, i cui neuroni sono stati collegati mediante modelli sinaptici biologicamente realistici (Nieus et al., 2006) capaci di riprodurre la natura stocastica della trasmissione sinpatica. Inoltre le sinapsi afferenti alla GrC e alla GoC sono costituite da recettori sinaptici con dinamiche di decadimento caratterizzate da costanti temporali nell’ordine dei 150-200 ms (rif. Metodi). La trasmissione dei potenziali d’azione attraverso tali sinapsi può quindi interferire con i meccanismi all’origine della risonanza intrinseca delle cellule. La necessità di studiare il fenomeno di risonanza dell’intero circuito base ha richiesto la costruzione di un suo modello. Tale modello è stato utilizzato per produrre i risultati ivi esposti da un totale di 12.000 simulazioni computazionali della attivazione delle cellule granulari.
In un primo momento nella costruzione del modello del circuito sono state inserite sinapsi di tipo deterministico, le quali convertono i PdA presinaptici in potenziali postsinaptici equivalenti alla risposta media calcolata sulla base del rilascio stocastico vescicolare. Tale modello non mostrava il fenomeno di risonanza a basse frequenze (Fig. 32 traccia rossa) descritto nei singoli modelli di Grc e Goc. Questo risultato ha messo in evidenza il fatto
76 che dovevano esserci ulteriori elementi di tipo circuitale tali da permettere la persistenza del fenomeno e che questi elementi potevano risiedere nella stocasticità della neurotrasmissione. Le sinapsi stocastiche rappresentano la realtà del rilascio sinaptico vescicolare ed il risultato ottenuto con l’inserzione di queste tipologie sinaptiche è stato rilevante. L’aggiunta delle sinapsi stocastiche si è rivelata fondamentale per la persistenza della risonanza in banda θ indicando l’importanza e la dipendenza del fenomeno stesso dal meccanismo stocastico della neurotrasmissione. Inoltre questi risultati ampliano la lista degli elementi “amplificatori” presenti nel circuito; infatti i dati mostrano che per la generazione di risonanza nel circuito neuronale studiato non sono sufficienti la corrente KM e la corrente Nap ma che entrano in gioco ulteriori elementi: la neurotrasmissione
sinaptica e la corrente NMDA, i quali hanno la funzione di “amplificatori”. Per capire se questi elementi funzionano anche da “risuonatori” si dovrebbe bloccare totalmente la corrente KM; studi modellistici futuri potranno essere indirizzati verso la validazione o meno di tale teoria.
Dopo aver verificato la persistenza della risonanza nel circuito, il passo successivo è stato la modulazione della stessa agendo sull’elemento “risuonatore” alla base della generazione della risonanza: la corrente KM. Abbiamo modulato la conduttanza di questo canale sia in positivo, aumentandola, simulando l’azione della RTG (farmaco anticonvulsivante, Tatulian et al., 2001), sia in negativo dimezzandone il valore di riferimento (da 0,001 S/cm2 a 0,0005 S/cm2). In entrambi i casi abbiamo ottenuto dei risultati inaspettati. Con la RTG, agonista del canale KM, ci saremmo aspettati un aumento della risonanza mentre i risultati non mostrano alcun miglioramento nè peggioramento statisticamente significativo nel profilo dell’ IdR (Fig. 34 tracce verde e azzurra). Dimezzando il valore della conduttanza KM invece ci saremmo aspettati un peggioramento nel profilo dell’ IdR mentre i risultati non evidenziano alcun cambiamento statisticamente significativo. Un interessante studio futuro potrebbe mirare ad una ulteriore modulazione negativa della conduttanza KM diminuendo ancora il suo valore, o addirittura azzerandolo ed analizzare il profilo dell’IdR da esso generato.
I risultati riportati in questa tesi mostrano innanzitutto la persistenza della risonanza a livello circuitale evidenziando che le proprietà elettrofisiologiche intrinseche delle singole cellule non sono sufficienti nella generazione della risonanza nel circuito ma devono intervenire ulteriori fattori di tipo circuitale: le sinapsi stocastiche, da cui dipende il fenomeno di risonanza in banda θ nel circuito dello strato granulare.
77 La modulazione negativa della KM non è sufficiente a spegnere la risonanza mentre la mancata neurotrasmissione stocastica annulla la risonanza per le frequenze comprese nella banda θ.
Per la generazione di questo interessante fenomeno all’interno del circuito dello strato granulare cerebellare è necessaria la presenza dei meccanismi stocastici legati al rilascio vescicolare dalla quale la risonanza risulta essere dipendente.
In conclusione questo lavoro di tesi ha mostrato la persistenza del fenomeno di risonanza all’interno del modello del circuito dello strato granulare cerebellare da noi costruito mettendo in risalto l’importanza e la dipendenza dalle componenti circuitali, i meccanismi stocastici di neurotrasmissione, per l’amplificazione della risonanza stessa. Inoltre ha mostrato come la modulazione, sia positiva sia negativa, della conduttanza KM non porti a differenze statisticamente significative nei profili dell’IdR accentuando ulteriormente l’importanza delle sinapsi stocastiche.
I dati riporati in questo studio saranno in futuro testati sperimentalmente e potranno essere utilizzati al fine di dirigere studi sperimentali verso un approccio corretto limitando quindi i costi e il tempo impiegati.
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RINGRAZIAMENTI
Ringrazio il Prof. D’Angelo che mi ha permesso di poter svolgere all’interno del suo laboratorio di Neurofisiologia presso l’Università di Pavia questa tipologia di tesi, per
un Biologo un pò fuori dal comune. Grazie per avermi permesso di conoscere ed approfondire un argomento a me caro: le Neuroscienze Computazionali. Un grazie particolare lo devo a Sergio che mi ha seguita, aiutata, spronata durante lo
svolgimento della tesi, mi ha fatto appassionare all’argomento, mi ha supportata nei momenti di difficoltà e mi ha sempre aiutata a trovare una soluzione alle problematiche
che sono venute fuori durante questo anno.
Ringrazio Paola perchè è grazie a lei che ho potuto scoprire questo laboratorio ed è stata lei a farmi conoscere il Prof. D’Angelo ed i suoi collaboratori affinchè mi potessi inserire
all’interno di questo gruppo di lavoro.
Ovviamente ringrazio anche tutti i collaboratori del laboratorio del Prof. D’Angelo che mi hanno offerto la loro amicizia e il loro aiuto nei momenti di bisogno: Fabio, Eugenio,
Stefano, Fabio, Francesca, Irene, Francesca, Gigi, Valeria, Daniela, Jonathan ed Elisabetta.
Ringrazio la Prof.ssa Scuri che da relatore interno mi ha seguita durante le fasi più importanti della tesi e che mi ha dato sempre ottimi consigli nello svolgimento di questo
lavoro; grazie anche per aver supportato questa mia scelta di tesi esterna.
A questo punto devo un ringraziamento enorme alla mia famiglia, perchè è grazie ai miei genitori se ho potuto svolgere questa tesi esterna: grazie per avermi dato la possibilità di svolgere questa tesi, so quanti sacrifici avete fatto per potermi permettere di vivere molti
mesi lontano da casa e per questo non smetterò mai di ringraziarvi, siete dei genitori meravigliosi!
Grazie Enrico che in questo anno non hai mai smesso di spronarmi, di starmi vicino, di aiutarmi; grazie per le nottate passate insieme a me ad aspettare risultati delle simulazioni, a scrivere, a modificare figure. Grazie per aver condiviso con me ogni
momento, ogni gioia, ogni risultato ottenuto, ogni delusione. Grazie per avermi sopportata nei momenti di crisi nera dove tutto sembrava perduto, per aver ascoltato i
miei monologhi senza senso nel mezzo del giorno e della notte, per aver cercato di tranquillizzarmi nei momenti di preoccupazione, per non aver mai smesso di credere in
me. Sei stato il mio punto di riferimento, grazie di esserci stato, sempre.
Infine mi viene dal cuore ringraziare tutti quegli Amici che in quest’anno, nonostante la lontananza, mi sono sempre stati vicino e mi hanno sempre supportata: Marco, Erika, Teresa, Clemy, Sara, Perla, Dario...Grazie a tutti per avermi sostenuta in questi mesi e