I risultati di questo lavoro di tesi confermano che tireociti umani in coltura primaria secernono CXCL8 in condizioni basali e che il TNF-α è un potente induttore della secrezione di questa chemochina. Inoltre i risultati indicano che sia gli Interferoni di tipo I che di tipo II hanno un effetto inibitorio (dose-dipendente) sulla secrezione di CXCL8 da parte di tireociti umani, sia in condizioni basali che dopo induzione con TNF-α. In uno studio precedente, gli Interferoni di tipo I e di tipo II sono stati confrontati per la loro capacità di indurre la secrezione di CXCL10 in tireociti umani in coltura [150].
Al contrario, nel presente lavoro di tesi, gli Interferoni di tipo I e di tipo II sono stati confrontati per la loro capacità di modulare negativamente la secrezione di CXCL8 in tireociti umani in coltura primaria.
Dai risultati ottenuti emerge che:
i. Gli Interferoni di tipo I e di tipo II regolano negativamente e in modo dose-dipendente la secrezione di CXCL8, sebbene con diverso potere;
ii. Sia la secrezione di CXCL8 basale che indotta dal TNF-α viene inibita dagli Interferoni di tipo I e di tipo II;
iii. Gli Interferoni non revertono completamente nè la secrezione di CXCL8 basale nè quella indotta dal TNF-α.
Precedenti evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo del TNF-α nelle AITD in quanto questa citochina agisce sinergicamente con gli Interferoni nel promuovere la secrezione delle chemochine leganti il recettore CXCR3 [16,151]. Per questo motivo l'antagonismo tra queste citochine pro- infiammatorie, descritto dal presente lavoro, può risultare inaspettato.
Tuttavia anche dati ottenuti da studi precedenti, effettuati su cellule endoteliali (HUVEC) [148], su fibroblasti [146], leucociti [147], e cellule di astroglioma [145], hanno riportato un significativo effetto inibitorio esercitato dagli IFNs di tipo I e di tipo II sia sulla secrezione di CXCL8 basale che indotta da citochine.
Dal momento che non è ancora noto il ruolo di CXCL8 nelle AITD, risulta difficile dare un'interpretazione dei dati ottenuti, ma possono comunque essere effettuate alcune considerazioni. E' noto che l'IFN ha un ruolo chiave nelle AITD per la sua capacità di indurre l'espressione di diversi geni pro-infiammatori. Da un recente studio [150] e dal presente lavoro è emerso un doppio effetto degli IFNs: da una parte, gli IFNs stimolano la secrezione di CXCL10 (che ha un ruolo nella patogenesi delle AITD, ma non è costitutivamente presente), dall'altra, gli IFNs inibiscono la secrezione di CXCL8 (secreto costitutivamente). Il fatto che cellule tiroidee in
coltura secernono CXCL8 in condizioni basali, e la recente dimostrazione che lo iodio aumenta significativamente l'espressione dell'mRNA di CXCL8 in modo tempo-dipendente e concentrazione-dipendente, suggeriscono che CXCL8 possa avere un ruolo nel corso clinico delle AITD [78]. Si potrebbe supporre che negli stadi iniziali delle AITD, quando sono presenti alti livelli di IFN, l’espressione di CXCL8 viene “down-regolata”, mentre altre chemochine, che legano il recettore CXCR3 (CXCL9, CXCL10, CXCL11), sono presenti ad alti livelli; con il progredire delle AITD, i livelli di TNF-α aumentano, quindi la secrezione di CXCL8 viene notevolmente stimolata, mentre la secrezione delle altre chemochine CXCR3-dipendenti viene inibita. Infatti studi clinici indicano che un aumento della produzione del TNF-α, uno dei maggiori induttori della secrezione di CXCL8, sia richiesto per iniziare o sostenere la remissione della patologia di Graves [152]. Questa osservazione supporterebbe indirettamente l'ipotesi formulata.
Sono stati condotti diversi studi atti a dimostrare un ruolo per CXCL8 nelle AITD attraverso misurazioni dei livelli sierici della chemochina in pazienti con patologie tiroidee autoimmuni. Due di questi studi hanno riportato elevate concentrazioni circolanti di CXCL8 in pazienti con GD rispetto a controlli sani [149,153]. Questo dato non è stato confermato dallo studio di Krassas et al. in cui non si evidenziano livelli elevati di CXCL8 in pazienti con GD, gozzo nodulare tossico o tiroidite di Hashimoto [153]. Anche nel presente studio non sono state osservate differenze significative nei livelli sierici medi di CXCL8 in pazienti eutiroidei affetti da morbo di Graves comparati con soggetti sani. Emergono dunque dati discrepanti dovuti alla grande variabilità nei livelli sierici di citochine e chemochine durante il corso delle AITD, in quanto influenzati da diversi parametri clinici quali durata e attività della patologia, trattamento farmacologico e stato funzionale della tiroide [16,98,151,155-157]. Infatti negli studi precedentemente menzionati sono stati reclutati pazienti a diversi stadi della patologia e questo può facilmente spiegare i risulati discrepanti che sono stati ottenuti. La valutazione dei livelli sierici di CXCL8 in bambini in età pediatrica con GD ha evidenziato livelli elevati in pazienti non trattati e ipertiroidei, e livelli normali a seguito di trattamento farmacologico di 24 mesi con metimazolo che ripristinato la condizione eutiroidea [158]. Siddiqi ha trovato elevati livelli sierici di CXCL8 non solo in pazienti ipertiroidei con GD, ma anche in pazienti con tireotossicosi dovuta a gozzo nodulare tossico o in quelli trattati con levotiroxina TSH- soppressiva [149]. La prova finale che gli alti livelli sierici di CXCL8 osservati in pazienti con GD sono la conseguenza, piuttosto che la causa dell’ipertiroidismo, è fornita dalla dimostrazione che gli ormoni tiroidei, ed in particolate T3, stimolano in modo tempo- e dose-dipendente la
produzione di CXCL8 da parte di osteoblasti umani e cellule stromali di midollo osseo in coltura primaria [148]. Nello stesso studio gli Autori hanno ipotizzato che l’induzione della trascrizione dell’mRNA per CXCL8 mediata da T3 sia dovuta o ad up-regolazione della trascrizione genica o alla stabilizzazione dell’mRNA per CXCL8. I dati ottenuti dai predetti studi condotti in vivo ed in vitro indicano che l’ipertiroidismo “per se”, piuttosto che la patologia infiammatoria autoimmune, sia responsabile dell’aumento dei livelli circolanti di CXCL8. Gli IFNs di tipo I e di tipo II down-regolano la secrezione di CXCL8 in diverse cellule umane, cellule endoteliali (HUVEC) [148], fibroblasti [146], leucociti [147] e cellule di astroglioma [145]e il presente studio dimostra che l’IFN-γ inibisce in modo dose-dipendente sia la secrezione basale di CXCL8 sia quella indotta da TNF-α in cellule tiroidee in coltura primaria. Dal momento che l’IFN-γ è la citochina cardine della risposta Th1 e dato il suo ruolo rilevante nella patogenesi delle AITD, il fatto che l’IFN-γ moduli negativamente la secrezione di CXCL8 supporta indirettamente il concetto che CXCL8 abbia un ruolo minore nella patogenesi delle AITD.
Il disegno sperimentale del presente studio non permette di trarre delle conclusioni sui meccanismi attraverso i quali gli IFNs regolino negativamente la secrezione di CXCL8, ma possono essere comunque effettuate alcune considerazioni. L'azione inibitoria degli IFNs è stata osservata anche quando queste citochine sono state aggiunte dopo il TNF-α, come riportato anche da Oliveira et al. [146]. Questa osservazione indica che gli IFNs non esercitano il loro effetto inibitorio all’inizio della via di stimolazione dell'espressione del gene di CXCL8. In più il fatto che l'effetto inibitorio dell'IFN-β diminuisca con l’aumento dei tempi di preincubazione, infatti l’effetto inibitorio risulta assente quando l'IFN viene aggiunto più di quattro ore prima del TNF-α, potrebbe far pensare che l’inibizione sia mediata da proteine indotte dall'IFN [146]. Inoltre dati precedenti hanno dimostrato che mentre gli IFNs inibiscono in modo specifico l'espressione di CXCL8, attivano altri geni regolati da NF-kB, come dimostrato dall'aumento della secrezione di altre chemochine come CXCL10 [145]. Questo indicherebbe che gli IFNs non interferiscono con l'attivazione di NF-kB ma che potrebbero alterare specifici elementi regolatori della trascrizione a livello della regione promotore di CXCL8. Altri meccanismi possibilmente coinvolti includono:
i. effetto sulle modificazioni post-trascrizionali di NF-kB p65 che altera la capacità di NF-kB p65 di associarsi con proteine a livello di regioni promotori [145];
ii. soppressione della stabilità e dell’accumulo dell' mRNA [145].
Più recentemente è stato dimostrato attraverso esperimenti condotti su linee cellulari mancanti di alcuni componenti del complesso ISGF3 che l'IFN-β inibisce CXCL8 attraverso ISGF3 [159].
Quindi tutti i dati ad oggi disponibili supportano l'idea che diversi meccanismi possono essere coinvolti nell'inibizione di CXCL8 mediata dagli IFNs. In conclusione i risultati di questo studio confermano che tireociti umani in coltura primaria secernono CXCL8 sia a livello basale che dopo stimolazione con TNF-α e dimostrano che gli IFNs di tipo I e di tipo II possono regolare negativamente la secrezione di CXCL8 da parte dei tireociti, l'IFN-γ è tra questi il più potente inibitore.
Saranno necessari futuri studi (clinici e in vitro) per poter comprendere a pieno il ruolo di CXCL8 nelle patologie tiroidee.
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