RISULTATI E DISCUSSIONE Analisi mutazionale dei pazienti JS
Grafico 1: Distribuzione della percentuale di geni mutati riscontrati nella casistica totale raccolta e la loro
correlazioni con i fenotipi clinici.
L’impiego della tecnologia NGS ha consentito di diagnosticare in tempi rapidi un numero elevato di mutazioni patogenetiche, rispetto alle tecniche tradizionali
utilizzate in precedenza che richiedevano tempi di analisi molto più lunghi.
In 66 pazienti sono state identificate varianti patogenetiche in singoli alleli.
Recentemente Lindstrand e collaboratori hanno descritto 72 pazienti affetti da
BBS studiati per la ricerca di CNV patogenetiche mediante l’utilizzo di un Array
Custom 4x180k costituito da 94 geni di cui 17 associati a BBS e la restante parte
correlati ad altre ciliopatie. Lo studio ha permesso l’identificazione di
duplicazioni/delezioni muti-esoniche in 17 pazienti affetti (18,5%) (Lindstrand et
al. 2016). Alla luce di tale risultato e considerando il limite diagnostico della
tecnica NGS utilizzata, che non permette di identificare CNV, è stato disegnato
un Array Custom HD 8x15k (Agilent Technologies) ad alta densità sui geni
associati alla JS con l’obiettivo di individuare eventuali delezioni/duplicazioni
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eterozigote emersa dalla prima analisi. L’analisi dell’Array Custom è tuttora in
corso.
Tra le famiglie negative all’analisi di Target Resequencing sono state sottoposte
a WES 5 famiglie. L’analisi dei dati preliminari ha permesso, ad oggi,
l’identificazione del difetto molecolare responsabile del fenotipo patologico in un nucleo familiare in cui è stata evidenziata la presenza di due varianti in eterozigosi
composta nel gene SUFU.
Studio mutazionale del gene C5orf42 in pazienti JS (Romani et al. 2015)
Il gene C5orf42 è stato identificato dal gruppo di Srour e collaboratori in 10
pazienti con un fenotipo neuroradiologico e clinico di JS pura, in un solo caso
associato a polidattilia pre- e post-assiale (Srour et al. 2012). Successivamente
sono stati descritti altri pazienti con fenotipo JS puro associato in un caso a
retinopatia ed in un altro ad encefalocele occipitale (Alazami et al. 2012; Ohba et
al. 2013). Quest’ultimo difetto cerebrale è stato riportato in un feto mutato in
C5orf42 in associazione con labioschisi e palatoschisi, dotto arterioso pervio e
idrocefalo in assenza di polidattilia o altri segni oro-facciali.
Nel 2014, Lopez e collaboratori hanno eseguito WES in 11 famiglie con sindrome
OFDVI individuando mutazioni nel gene C5Orf42 in 9 pazienti (82%),
suggerendo che questo gene potrebbe rappresentare la principale causa genetica
di tale condizione (Lopez et al. 2013). Precedentemente mutazioni rare nei geni
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OFDVI (Coene et al. 2009; Valente et al. 2010; Darmency-Stamboul et al. 2013),
ma la definizione genetica di questa sindrome è rimasta a lungo non determinata.
Dei 12 pazienti mutati riportati da Lopez e collaboratori, soltanto 4 erano viventi
e rientravano nei criteri diagnostici di OFDVI: tutti avevano MTS associato a
multipli frenuli linguali con o senza amartomi (criterio diagnostico) e polidattilia
pre-assiale, variabilmente associata ad altri difetti di tipo oro-facio-digitali. Due
di essi mostravano anche amartomi ipotalamici e altri difetti a carico del sistema
nervoso centrale (porencefalia, eterotopia nodulare, polimicrogiria, agenesia del
corpo calloso). Gli altri otto pazienti (da 6 famiglie) erano feti con anomalie
cerebellari assimilabili all’MTS e varie combinazioni di polidattilia pre-, meso- o
post-assiale; in tali feti le caratteristiche orali erano assenti o difficilmente
valutabili (solo un paziente presentava frenuli multipli). Inoltre, alcuni pazienti
presentavano anomalie scheletriche associate, difetti cardiaci, utero setto e
microftalmia (tabella 2) (Lopez et al. 2013).
Ad oggi, dei 416 probandi analizzati sono state identificate mutazioni
patogenetiche nel gene C5orf42 in 36 pazienti, che rappresentano il 9% della
casistica. Tale risultato indica un coinvolgimento rilevante del gene C5orf42 nella
patogenesi della JS.
Nell’ambito del progetto di dottorato, nel 2015 è stato oggetto di una pubblicazione sulla rivista Human Genetics (Paper Allegato) un studio condotto
su 17 pazienti della casistica (fino al 2014) con diagnosi di OFDVI (Romani et al.
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Dei diciassette probandi analizzati soltanto tre (17,6%) sono risultati portatori di
varianti patogenetiche nel gene C5orf42, una percentuale molto più bassa di
quella descritta da Lopez (9/11 - 82%). I tre pazienti mutati presentavano MTS
associato ad amartomi linguali e polidattilia meso e/o post-assiale; in un paziente,
inoltre, erano presenti frenuli multipli e la RMN mostrava la presenza di
amartoma ipotalamico, corpo calloso sottile e polimicrogiria bilaterale (paziente
11 in (Poretti et al. 2012)). Lo screening ha inoltre consentito di identificare una
mutazione emizigote nel gene OFD1 (c.2315dupT; p. P772Tfs*4) in un quarto
paziente (COR211) con sindrome OFDVI (JS con frenuli linguali multipli e
polidattilia post-assiale delle mani). Nessun’altra mutazione patogenetica è stata
riscontrata nei rimanenti 14 pazienti con fenotipo OFDVI.
I risultati ottenuti confermano che le mutazioni di C5Orf42 possono causare
OFDVI di gravità variabile, ma indicano anche che il fenotipo OFDVI ha una più
ampia eterogeneità genetica rispetto a quanto descritto da Lopez.
Oltre ai tre casi con fenotipo OFDVI, sono stati individuati altri 19 pazienti
portatori di mutazioni in C5Orf42, di cui 18 con fenotipo JS puro ed uno soltanto
con retinopatia. Le caratteristiche cliniche e neuroradiologiche sono descritte in
tabella 2.
L'identificazione di mutazioni C5Orf42 in pazienti con un fenotipo di JS pura è
pienamente in linea con i risultati precedentemente riportati in letteratura. Infatti,
considerando i pazienti finora riportati con mutazioni patogenetiche di C5Orf42
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soltanto in due casi), mentre meno di un terzo presenta i criteri diagnostici
d’inclusione della sindrome OFDVI.
Il coinvolgimento renale o epatico non è stato mai riportato in associazione con
le mutazioni in C5Orf42, mentre la polidattilia, di qualsiasi tipo, sembra essere un
evento più frequente, presente nel 42% dei pazienti.
Fino ad oggi non sono stati pubblicati screening del gene C5Orf42 in feti con
MKS. Un ruolo di questo gene nella patogenesi di questa sindrome letale sembra
improbabile sia per l’assenza di associazione con la malattia cistica renale che la fibrosi epatica congenita, che sono due principali caratteristiche diagnostiche
della MKS, sia per la rara presenza di encefalocele occipitale, che è stato descritto
in percentuali molto basse. Non è possibile, ad oggi, definire chiare correlazioni
genotipo-fenotipo, poiché mutazioni troncanti e missenso del gene C5Orf42 sono
distribuite lungo la sequenza dell’intero gene e sono state riscontrate sia in pazienti con un JS pura che con OFDVI indipendentemente dalla severità del
quadro clinico. È possibile ipotizzare, come già suggerito per altre ciliopatie, che
ulteriori varianti non ancora identificate in geni differenti possono agire come
modificatori genetici del fenotipo ed influenzare, di conseguenza, la penetranza e
l'espressione delle caratteristiche ora-facio-digitali dei pazienti portatori di
mutazioni nel gene C5Orf42. Allo stato attuale, l'identificazione di tali
modificatori, quindi, rappresenta una delle più grandi sfide che ha come fine una
44 Srour AJHG Srour JMG Alazami HuMu Ohba Neurogen Lopez HumGen Shaheen EJHG Present study TOTAL (%) Nr. di pazienti 10 1 3 2 12 1 22 51 Fenotipi clinici#: - JS pura 10 1 2 2 - - 19 34 (66%) - JS con retina - - 1 - - - 1 2 (4%) - JS con rene - - - - - COR - - - - - JS with fegato - - - - - OFDVI (inclusi feti) - - - - 12(8 feti) - 3 15 (31%) - feti MKS-like - - - 1 - 1 (2%) Caratter. cliniche§: - segni neurologici 10 1 3 2 4 - 19 39 (100%) - retinopatia - - 1 - - - 1 2 (5%) -coinvolgimento rene/fegato - - - 0 - caratteristiche oro-facciali - - - - 6 1 3 10 (21%) - amartoma linguale / frenuli multipli* - - - - 5 - 3 8 (17%) - altre oro- facciali** - - - - 4 1 - 5 (10%) - polidattilia 1 - - - 12 - 7 20 (42%) - polid.mesoassiale* - - - - 6 - 2 8 (17%) - polid.preassiale 1 - - - 12 - 2 15 (31%) - polid.postassiale 1 - - - 9 - 4 14 (29%) - altri difetti SNC - - 1 - 9 1 4 15 (31%) - amartoma ipotalam* - - - - 5 - 1 6 (12%) - encefalocele occip. - - 1 - - 1 1 3 (6%) - altri difetti SNC*** - - - - 4 - 2 6 (12%) - altri difetti cong.**** - - - 1 7 1 3 12 (25%)
Tabella 2: Prevalenza delle caratteristiche cliniche dei pazienti mutate in C5Orf42 descritti fino ad oggi: #come
descritto in Romani et al, 2013;§ non sono conteggiati nelle percentuali i 3 pazienti senza questionario clinico*sufficiente per la diagnosi di OFDVI in associazione con MTS (Poretti et al, OJRD 2013); **labio e/o palate schisi, alterazioni dentarie, lingua lobulata, frenula corti; ***porencefalia, eterotropia nodulare, polimicrogiria, alterazioni del corpo calloso, idrocefalo, arinencefalia; ****alterazioni delle ossa corte e lunghe, cubito valgo,difetti cardiac ed aortici, utero setto, microftalmia, morbo di Hirschsprung, scoliosi.
Studio mutazionale del gene CEP120 in pazienti JS (Roosing et al. 2016)
Recentemente, mutazioni in CEP120 sono state riportate in quattro individui con
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ciliopatia scheletrica (Shaheen et al. 2015). Nell’ambito di questo dottorato, il
lavoro svolto in collaborazione con il gruppo del prof. Gleeson ha permesso
l'identificazione di mutazioni nel gene CEP120 in uno spettro di fenotipi che
vanno dalla JS pura a condizioni più gravi con caratteristiche fenotipiche che si
sovrappongono con altre ciliopatie distinte come MKS, JATD e OFD. Inoltre,
abbiamo descritto un paziente con disrafia tetto-cerebellare ed encefalocele
occipitale (tectal and cerebellar dysraphia with occipital encephalocele –
TCDOE) con varianti patogenetiche in questo gene, identificando la possibile
causa genetica di tale condizione. Lo scopo dello studio è stato di descrivere la
frequenza e lo spettro fenotipico delle mutazioni nel gene CEP120, oggetto della
pubblicazione su Journal of Medical Genetics (Roosing et al. 2016) (Paper
Allegato).
L’analisi è stata condotta su un numero totale di 491 pazienti di cui: 346 provenienti dal nostro screening di target resequencing di 120 geni ciliari, e 145,
di cui 21 feti affetti da MKS e uno da TCDOE, analizzati nel laboratorio Gleeson
mediante WES. Mutazioni bialleliche sono state individuate in 4 probandi affetti
da una forma di JS pura (0,8%) e due feti con diagnosi di MKS e TCDOE. Sono
stati, inoltre, analizzati 15 pazienti con fenotipo ODFVI, tutti risultati negativi
all’analisi mutazionale del gene suggerendo che mutazioni di CEP120 non contribuiscano a questo specifico fenotipo. In conclusione, tale studio aggiunge
CEP120 alla lista di geni causativi di ciliopatie clinicamente distinte ma
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caso di TCDOE, confermando quanto precedentemente suggerito da Poretti e
collaboratori (Poretti et al. 2011) sull’inclusione di tale fenotipo morfologico
all'interno dello spettro JS.
Identificazione di un nuovo gene associato a JS mediante analisi WES (De Mori et al. 2017)
Il pathway di Sonic Hedgehog (SHH) rappresenta una via di segnale nella
regolazione dello sviluppo embrionale, principalmente del Sistema Nervoso
Centrale e degli arti. La via di segnale di SHH è mediata dal cilio primario e i
difetti genetici che coinvolgono tale via o proteine ciliari ad essa associata sono
causa di un ampio spettro di disturbi dello sviluppo. Lo studio condotto in
collaborazione con il gruppo del Prof. Gleeson ha permesso l’identificazione di
varianti patogenetiche missenso in omozigosi nel gene SUFU (NM_016199.3),
recentemente pubblicato sulla rivista The American Journal of Human Genetics
(De Mori et al. 2017) (Paper Allegato).
L’analisi WES ha evidenziato mutazioni patogenetiche nel gene SUFU in quattro bambini di due famiglie non consanguinee affette da JS (COR369 da Italia e MTI-
2023 da Egitto) con caratteristiche cliniche sovrapponibili. Sono stati
complessivamente testati 385 probandi con JS mediante protocollo WES, 346
probandi con SJ tramite protocollo target resequencing, 60 probandi con
polimicrogiria isolata e 100 soggetti di controllo italiani tramite sequenziamento
diretto Sanger dei 12 esoni del gene. Dall’analisi 12/731 (1,6%) pazienti sono
risultati portatori su un singolo allele di varianti rare nel gene SUFU, mentre
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di controllo. Varianti eterozigoti loss-of-function di SUFU sono note predisporre
alla sindrome di Gorlin, caratterizzata da carcinomi ad esordio precoce ed
anomalie scheletriche (Pastorino et al. 2009; Kiwilsza and Sporniak-Tutak 2012),
mentre varianti eterozigoti sia somatiche che germinali di SUFU rappresentano
un fattore di suscettibilità per lo sviluppo di tumori quali meningioma o
medulloblastoma (Taylor et al. 2002; Brugieres et al. 2010; Aavikko et al. 2012;
Brugieres et al. 2012). Nessuno dei 12 probandi analizzati presentava tumori o
segni della sindrome di Gorlin. Otto delle varianti eterozigoti identificate sono
state predette come benigne, di cui, 4 sono di splicing e 3 sono loss-of-function
(figura 4). È interessante notare che la frequenza delle varianti eterozigoti loss-of-
function in SUFU tra i soggetti affetti da JS (3/761) è nettamente superiore alla
frequenza riportata nel database gnomAD (4/138.629), suggerendo un potenziale
ruolo di aploinsufficienza del gene SUFU nella determinazione del fenotipo JS.
La macrocefalia e/o l’ipertelorismo sono stati riportati precedentemente in un
sottoinsieme di bambini affetti da medulloblastoma con varianti eterozigoti loss-
of-function in SUFU, ma nessuno di essi presentava segni di malformazioni
cerebellari congenite suggestive di JS (Brugieres et al. 2012). Al momento, il
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Figura 4: het: eterozigote; WT: wild type. # varianti bialleliche patogene in questi geni si separano con la malattia nelle famiglie; ## riportata in eterozigosi in un paziente sporadico con medulloblastoma.
L’analisi di filtraggio dei dati WES nelle due famiglie è stata condotta seguendo due pipelines bioinformatiche differenti nei due laboratori. Nella famiglia
COR369 sono emerse due varianti in omozigosi in due geni distinti: c.1217T>C
(p.Ile406Thr) in SUFU e c.2146A>T (p.Thr716Ser) in CDHR1 (NM_033100),
mentre nella famiglia MTI-2023 il filtraggio applicato ha evidenziato soltanto una
variante in omozigosi c.527A>G (p.His176Arg) nel gene SUFU. Tutti i soggetti
presentavano diagnosi clinica di JS. Tre di loro avevano polidattilia post-assiale e
due macrosomia globale con macrocefalia. La RMN dell’encefalo ha evidenziato
un MTS lieve in tutti i bambini. Inoltre, i due fratelli della famiglia COR369
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Il gene SUFU codifica per una proteina che svolge un ruolo principale come
regolatore negativo del pathway di SHH, essenziale per il corretto sviluppo
embrionale. Infatti, topi Sufu knock-out mostrano un fenotipo letale e nessun
variante patogenetica loss-of-function in omozigosi è stata mai riportata nei
database on line. La proteina Sufu presenta due conformazioni “aperta” e
“chiusa”.
Figura 5: RMN della ragazza affetta (H-K) e ragazzo (L-O) della famiglia COR369. Si noti l'ipoplasia lieve del
verme (H, L) ed i peduncoli cerebellari superiori allungati, ispessiti e orizzontalmente coerenti con MTS lieve (I, M) associati a polimicrogiria bilaterale che coinvolgono principalmente le regioni perisilviane (frecce in J, K, N, O). Si noti anche la megacisterna magna nell'immagine sagittale della ragazza (H). (P-S) RMN nel probando della famiglia MTI-2023. Si noti l'ipoplasia del verme, la megacisterna magna (P, Q), anomalie floliari displastiche (frecce curve in R), la fossa profonda interpedunculare e peduncoli cerebellari superiori orizzontalizzati (MTS, Q).
La forma “chiusa” è stabilizzata dal legame con le proteine del complesso GLI.
Cambiamenti nei residui critici nell’interfaccia di legame tra le proteine SUFU e GLI possono alterare il complesso ed impedire a SUFU di reprimere la
trascrizione GLI-mediata. Per valutare l'effetto patogenetico delle varianti
missenso identificate, è stato inizialmente studiato il loro impatto strutturale e
dinamico dimostrando in entrambe le mutazioni una significativa modificazione
dei siti di legame con conseguente alterazione funzionale degli stati aperto/chiuso
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dai pazienti hanno dimostrato che entrambe le varianti ipomorfiche recessive nel
gene SUFU inducono una disregolazione del pathway di SHH attraverso due
distinti meccanismi: da una parte riducendo l’emivita di SUFU all’interno delle cellule, dall’altra compromettendo selettivamente la sua interazione con GLI3 e la successiva formazione del repressore GLI3R. L’alterata repressione SUFU-
mediata del pathway di SHH è dimostrata anche dai ridotti livelli di espressione
nei diversi geni target (BCL2, GLI1 e PTCH1) nei fibroblasti mutati rispetto ai
controlli. In conclusione, lo studio funzionale ha dimostrato che varianti recessive
ipomorfiche nel gene SUFU possono alterare la stabilità e la funzione del pathway
di SHH, causando uno spettro peculiare di difetti dello sviluppo con caratteristiche
cliniche e fenotipiche comuni alle ciliopatie come la SJ ed i disturbi SHH-
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