*I dati presentati in questo capitolo sono unpublished e quindi da considerarsi confidenziali.
Come parte del lavoro di dottorato, oltre ai dati presentati nei precedenti capitoli,
sono state sottoposte ad analisi WES, su piattaforma HiSeq (Illumina), 11 famiglie
con malformazioni congenite cerebellari isolate oppure complicate da ulteriore
alterazioni sopratentoriali, di cui 5 con JS. Lo studio dei dati preliminari, ad oggi,
ha permesso l’identificazione del possibile difetto molecolare responsabile del fenotipo patologico in 3 nuclei familiari. Nello specifico è stato identificato:
- una mutazione in eterozigosi composta nel gene BRAT1 in una famiglia con due
fratelli affetti con un quadro di atrofia cerebellare non progressiva;
- una mutazione in omozigosi nel gene GSX2 in una famiglia affetta da
malformazione congenita della giunzione diencefalo-mesencefalica;
-una mutazione in omozigosi nel gene TTL in famiglia con due sorelle affette con
un quadro suggestivo di tubulinopatia.
Infine, dall’analisi del pannello NGS dei geni responsabili di varie forme di NPCA, sono state evidenziate mutazioni patogenetiche nel gene ROBO3 in due
famiglie affette con un clinico e neuroradiologico caratteristico della paralisi
orizzontale dello sguardo con scoliosi progressiva (HGPPS), e una mutazione de
100
Mutazioni del gene GSX2 causano anomalie congenite della giunzione diencefalo-mesencefalica
GSX2 (Genomic Screened homeobox 2) è un fattore di trascrizione appartenente
alla famiglia dei geni homeobox, regolatori chiave dei processi di sviluppo
embrionali, caratterizzati da un dominio di legame al DNA noto come homeobox
o homeodomain (HD). In particolare, GSX2 viene espresso nei progenitori
cerebrali embrionali a livello telencefalico, ed è necessario per la formazione e il
mantenimento dei neuroni della proiezione striatale e degli interneuroni del bulbo
olfattorio. Attraverso analisi WES è stata identificata in una famiglia non
consanguinea una varianti in omozigosi nel gene GSX2, c.26C>A (p.Ser9*). ed in
una seconda famiglia con una variante missenso patogenetica in omozigosi
c.752A>G (p.Gln251Arg) nello stesso gene. I soggetti portatori di tali varianti
mostravano alla RMN una malformazione congenita peculiare della giunzione
diencefalo-mesencefalica, caratterizzata da fusione ipotalamo-mesencefalica
(figura 21), un fenotipo assolutamente sovrapponibile a quello presentato dal topo
knock-out per GSX2. Inoltre, presentavano clinicamente un quadro di ritardo
dello sviluppo, tetraparesi spastica e movimenti ipercinetici. La variante missenso
p.Gln251Arg coinvolge un residuo amminoacidico altamente conservato del
101
Figura 21: Immagini di RMN di un paziente con mutazione nonsenso in GSX2. A-B Assiali; C Coronali (A) fusione
ipotalamo-mesencefalica; (B) agenesia del putamen; (C) agenesia dei bulbi olfattori.
L’analisi funzionale sui fibroblasti dei pazienti hanno mostrato livelli di espressione della proteina mutata più bassi rispetto a quelli della proteina
selvatica, causata da una ridotta espressione del gene stesso, verosimilmente
legata ad una alterata auto-regolazione trascrizionale (figura 21).
Figura 21: Fibroblasti di controllo e mutati (GSX p.Ser9*; GSX p.Gln251Arg) mostrano rispetto al WT una riduzione dei livelli di proteina mutata GSX p.Gln251Arg e nessuna espressione della proteina mutata GSX p.Ser9*
102
Entrambe le mutazioni causano importanti alterazioni nei livelli di espressione di
altri geni regolati da GSX2 (tra cui ASCL1 e PAX6). Tali dati confermano la
patogenicità delle varianti identificate nei due pazienti ed identificano il primo
gene responsabile di malformazione della giunzione diencefalo-mesencefalica.
Atrofia cerebellare non progressiva nei disordini BRAT1-correlati
Mutazioni recessive nel gene BRAT1 sono state principalmente associate ad una
rara patologia, letale in epoca neonatale, nota come “Rigidity and multifocal
seizure syndrome” (RMFSL). Tale sindrome è caratterizzata da microcefalia,
rigidità, crisi epilettiche focali farmaco-resistenti, apnea e bradicardia. La RMN
dell’encefalo può essere normale o mostrare uno spettro di alterazioni che varia dall’ipoplasia frontale all’atrofia cerebro-cerebellare (Puffenberger et al. 2012). Ad oggi stati descritti 24 pazienti con mutazioni patogenetiche in questo gene,
soltanto 20 dei quali rientrano nel fenotipo RMFSL. I rimanenti casi presentano
manifestazioni cliniche, neuroradiologiche ed elettroencefalografiche (EEG)
variabili, definendo un gruppo eterogeneo di disordini del neurosviluppo BRAT1-
correlati.
In una famiglia composta da due fratelli affetti è stata eseguita l’analisi di WES
su piattaforma HiSeq 2500 (Illumina). I due fratelli affetti di 12 e 7 anni, nati da
genitori non consanguinei, presentano un quadro di atassia congenita non
progressiva, ritardo psicomotorio di grado lieve e nistagmo, associato al riscontro
103
Figura 22: A-B Immagini di RMN dei due fratelli affetti. Mostrano atrofia cerebellare a carico del
verme e degli emisferi in assenza di alterazioni sovra tentoriali.
Il filtraggio per modello di ereditarietà recessivo ha evidenziato la presenza di due
varianti patogenetiche in eterozigosi composta nel gene BRAT1: c.638dupA
(p.Val214Glyfs*189) e c.1395G>A (p.Thr465Thr) (sito di splicing). L’analisi di
segregazione ha confermato lo stato di portatore sano in entrambi i genitori (figura
23).
Ad oggi è stata riportata in letteratura una singola famiglia con mutazioni nel gene
BRAT1 causative di atassia cerebellare non progressiva e ritardo psicomotorio, in
assenza di epilessia o anomalie EEG (Srivastava et al. 2016). Tale descrizione si
sovrappone al fenotipo clinico dei nostri pazienti. I dati ottenuti dimostrano come
i disordini BRAT1-correlati costituiscano uno spettro fenotipico variabile, dalla
104
Figura 23: Analisi di segregazione ed elettroferogramma delle mutazioni riscontrate nel gene BRAT1.
Identificazione di un possibile nuovo gene-malattia delle tubulinopatie
In una famiglia consanguinea composta da due sorelle affette di 9 e 6 anni, è stata
eseguita l’analisi di WES su piattaforma HiSeq 2500 (Illumina). Entrambe presentano un fenotipo clinico caratterizzato da ipotonia generalizzata, ritardo
dello sviluppo cognitivo e forame ovale pervio. Le immagini di RMN in figura 24
mostrano il quadro neurologico delle due sorelle affette. Le precedenti indagini
genetiche su geni responsabili di diverse forme di malformazioni dello sviluppo
corticale (TUBA1A, TUBB2B, TUBB3, TUBB2A e TUBB4A) e di NPCA (pannello
NGS) hanno dato esito negativo. L’analisi di filtraggio dei dati WES, seguendo
un modello di ereditarietà recessivo, ha evidenziato la presenza di una variante
missenso in omozigosi nel gene TTL: c.1013G>A; p.Cys338Tyr, patogenetica nei
siti di predizione in silico e non presente nei database pubblici. TTL (Tubulin-
Tyrosine Ligase) è un enzima citosolico coinvolto nella modificazione post-
105
del ciclo di tirosinazione tubulare all’interno dei microtubuli del citoscheletro
(Prota et al., 2013). L'α-tubulina nel microtubulo viene detirosinata al C-terminale
(Erck et al., 2003). Neuroni di topo con attività TTL -nulla presentano gravi difetti
dello sviluppo, tra cui aumento dell’estensione dei neuriti e differenziazione
prematura (Erck et al. 2005), dimostrando il suo coinvolgimento nello sviluppo
neuronale legato alla capacità di riconoscere e legarsi al nucleo globulare della
tubulina. Inoltre, Prota e collaboratori hanno dimostrato che il mutante R66E nella
regione N-terminale, abolisce la formazione del complesso tubulina-TTL, mentre
il mutante E331Q, nel C-terminale, inibisce l’attività catalitica di tirosinazione
della tubulina nei neuriti, determinando un aumento di circa il 40% della
lunghezza dei neuriti, paragonabile al fenotipo TTL-nullo di topo (Prota et al.
2013).
La variante identificata mediante WES è localizzata in posizione 338 e determina
la sostituzione di una Cisteina con una Tirosina. La mutazione si trova nella
regione C-terminale catalitica dell’enzima. I dati della letteratura suggeriscono in
modo chiaro che anche la variante p.Cys338Tyr possa verosimilmente alterare
l’attivita di tirosinazione da parte dell’enzima, così come si verifica nel mutante E331Q. Sono in corso studi funzionali e di modelling per dimostrare la reale
correlazione della variante con il fenotipo dei pazienti. Se i risultati funzionali
confermeranno l’impatto patogenetico della variante, il gene TTL rappresenterà un nuovo gene-malattia associato alle tubulinopatie con coinvolgimento
106
Figura 24: RMN delle due sorelle affette. (A)Immagine sagittare-T1mostra agenesia in MH ed ipoplasia in NS del
corpo calloso, ipoplasia del verme e ingrandimento del IV ventricolo comunicante con cisterna magna allargata, tronco encefalico displastico con istimo allungato e ponte ipoplastico. (B) Assiale-T1 mostra gangli basali dismorfici e incompleta separazione tra la testa del caudato e il nucleo lenticolare ("tubulina-like") causato da ipoplasia del braccio anteriore della capsula interna. In C-Dimmagini di RMN sopra di MH e sotto di NS: (C) peduncoli cerebellari superiori orizzontalizzati (freccia bianca) e (D) verme superiore displastico
Studio mutazionale del gene ROBO3 in pazienti con Oftalmoplegia esterna progressiva con scoliosi progressiva (HGPPS) ad esordio precoce
La sindrome HGPPS (“Horizontal Gaze Palsy with Progressive Scoliosis”) è una
rara patologia autosomica recessiva caratterizzata da paralisi orizzontale dello
sguardo e scoliosi progressiva ad esordio nell’infanzia e/o nell’adolescenza. È causata da mutazioni nel gene ROBO3 (cromosoma 11q), coinvolto in processi di
guida assonale. Ad oggi sono stati descritti circa 30 casi di HGPPS con mutazioni
distribuite lungo tutto gene, senza regioni di hotspot. La sindrome è caratterizzata
da un complesso quadro malformativo della fossa cranica posteriore con ipoplasia
cerebellare e del ponte, assenza dei collicoli faciali, mancata decussazione dei
peduncoli cerebellari superiori e schisi mediana del tronco encefalo, con aspetto
“a farfalla” del bulbo sulle sezioni assiali (Jen et al. 2004; Amouri et al. 2009; Abu-Amero et al. 2011; Volk et al. 2011).
107
I pazienti analizzati in questo studio presentano microcefalia, ritardo psicomotorio
di grado lieve, nistagmo pendolare, paralisi di sguardo orizzontale ed uno di essi
anche sindrome di Wolf-Parkinson-White. Entrambi hanno sviluppato nei primi
mesi di vita un’importante cifoscoliosi toracolombare progressiva con alto livello
di torsione. L’esame neuroradiologico ha documentato un quadro malformativo del tronco-encefalo caratterizzato da tronco sottile con schisi anteriore e
posteriore del bulbo, ponte piccolo con schisi posteriore e ispessimento dei
peduncoli cerebellari superiori (figura 25). Le immagini trattografiche hanno
mostrato un anomalo decorso dei tratti cortico-spinali e delle fibre trasverse a
livello del ponte, nonché la mancata decussazione dei peduncoli cerebellari
superiori (figura 26).
Figura25: Immagine assiale T1 che mostra un quadro malformativo del tronco-encefalo caratterizzato
da tronco sottile con schisi anteriore e posteriore del bulbo, ponte piccolo con schisi posteriore e ispessimento dei peduncoli cerebellari superiori.
108
Figura 26: Le immagini trattografiche mostrano un anomalo decorso dei tratti cortico-spinali e delle
fibre trasverse a livello del ponte, e la mancata decussazione dei peduncoli cerebellari superiori. Sulla base della diagnosi clinica e neuroradiologica di HGPPS, i 2 pazienti sono
stati sottoposti ad analisi NGS. In entrambi sono state individuate mutazioni
patogenetiche nel gene ROBO3.
La prima paziente HGPPS è risultata portatrice in eterozigosi composta di due
varianti patogenetiche c.1451G>A/c.569C>G; p.(P190R)/p.(W484X). La
variante p.P190R in un allele rappresenta residuo estremamente conservato e
localizzato nel dominio Ig-like II extracellulare. La sostituzione del residuo
prolina, amminoacido apolare, con un’arginina, amminoacido polare fortemente
basico, potrebbe determinare un’alterazione nella formazione della struttura
secondaria della proteina ed il suo folding riducendone la funzionalità o forse
sopprimendola del tutto. Nell’altro allele invece è presente la sostituzione di un
triptofano in posizione 484 con un codone di stop, il residuo è conservato ed è
109
missenso che coinvolge lo stesso residuo (p.W484R) ipotizzando che tale
mutazione possa causare una perdita di funzione di ROBO3 (Amouri et al. 2009).
Nel secondo paziente, è stata identificata una variante in omozigosi c.2108G>C;
p.R703P (rs121918271). Tale mutazione è nota e riportata precedentemente in
letteratura come patogenetica (Jen et al. 2004; Haller et al. 2008; Kurian et al.
2013).
I casi descritti in letteratura presentano un fenotipo HGPPS ma nessuno di essi
presentava un quadro scoliotico ad esordio prima del primo anno di vita o una
compromissione della conduzione cardiaca.
Entrambi i casi sottolineano quanto un’attenta osservazione clinica e genetica
permettano di effettuare diagnosi tempestive in casi malformativi complessi, con
miglioramento della gestione clinica del paziente e del counseling alle famiglie.
Identificazione della variante Arg480Trp nel gene SPTBN2 in un paziente con una forma congenita di SCA5 associata a deficit cognitivo
La SCA5 è un’atassia ereditaria autosomica dominante, con esordio tipico nella terza-quarta decade e fenotipo cerebellare puro, a lenta progressione. I rari casi
riportati sono causati da mutazioni missenso o in-frame nel gene SPTBN2, che
codifica per la subunità β-III della spectrina, altamente espressa nelle cellule del
Purkinje e coinvolta nel trasporto assonale e nella stabilizzazione delle proteine
di membrana (Ikeda et al. 2006). Un fenotipo più grave di atassia cerebellare
(SCAR14,), con esordio in età pediatrica e associato a ritardo dello sviluppo
110
autosomico recessiva, causati da mutazioni troncanti o di splicing allo stato
omozigote (Lise et al. 2012; Elsayed et al. 2014).
In una paziente di 2 anni, con atassia cerebellare congenita associata a ritardo
psicomotorio, dolicocefalia, strabismo convergente alternante, ipotonia
generalizzata e iporeflessia degli arti inferiori, l’analisi del pannello NGS di 44
geni causativi di NPCA ha evidenziato la presenza della variante eterozigote de
novo c.1438 C>T; p.(Arg480Trp) (rs397514749) nel gene SPTBN2 (figura 27).
Figura27: Elettroferogramma della segregazione della variante p.(Arg480Trp) nel gene SPTBN2. (A)
Padre, (B) Paizente e (C) Madre. Conferma l’origine de novo della variante in eterozigosi nel paziente. L’analisi comparativa degli ampliconi del gene ha escluso la presenza sull’altro allele di delezioni o duplicazioni esoniche. La RMN dell’encefalo ha mostrato un
quadro di ipoplasia cerebellare globale con ampliamento dei solchi cerebellari, in
assenza di alterazioni troncoencefaliche (figura 28). Tale variante, già riportata in
Figura 28: RMN della paziente all’età di 2 anni mostra un quadro di ipoplasia cerebellare globale con
111
eterozigosi in due casi sporadici con fenotipo analogo ad esordio precoce (Jacob
et al. 2013; Parolin Schnekenberg et al. 2015), interessa un dominio ripetuto e
altamente conservato, coinvolto nella formazione di dimeri di β-III spectrina
necessari al corretto assemblaggio della proteina. La patogenicità della variante è
stata confermata da studi funzionali (Clarkson et al. 2014; Parolin Schnekenberg
et al. 2015).
Il caso riportato, unitamente ai due precedentemente descritti, suggeriscono
l’esistenza di uno specifico fenotipo Arg480Trp-correlato, assimilabile a quello caratteristico della SCAR14 ma trasmesso con modalità autosomico dominante,
sottolineando l’estrema complessità legata ai disordini monogenici e fornendo indicazioni utili alla pratica clinica.
112
CONCLUSIONI
Il progetto di ricerca supportato dall’ European Research Council (ERC), di cui è
parte il presente lavoro di dottorato, ha l’obiettivo di migliorare la classificazione
clinica e neuroradiologica delle malformazioni del cervelletto e del
troncoencefalico, identificare nuovi geni causativi ed infine definire la prevalenza
e lo spettro mutazionale dei geni noti.
Il lavoro prodotto ben riflette, nelle sue sezioni il percorso di grande cambiamento
che la ricerca ha intrapreso negli ultimi anni. L’NGS rappresenta la tecnica
d’elezione nella diagnosi e nella ricerca in malattie multigeniche e i risultati ottenuti nel corso di tale progetto ne confermano l’efficacia, suggerendo un
approccio WES come strategia analitica di elezione nel caso di fenotipi aspecifici
favorendo una notevole riduzione dei tempi diagnostici. I progressi nelle tecniche
di genetica molecolare, unitamente al campo delle neuroimmagini, stanno
rendendo sempre più affascinante ed interessante lo studio delle malformazioni
congenite del cervelletto, caratterizzate da numerose condizioni distinte le cui basi
genetiche ancora devono essere largamente elucidate.
La diagnosi nel paziente deve essere ricercata combinando le caratteristiche
cliniche e neuroradiologiche al fine di ottenere una fenotipizzazione più
approfondita che risulta essenziale ai fini della diagnosi genetica.
Il progetto di ricerca proseguirà nel percorso di individuazione di nuove mutazioni
patogenetiche in geni noti e di identificazione di geni-malattia mediante protocolli
113
genetici sono disponibili soltanto per un sottogruppo di esse e non coprono il
100% delle diagnosi. Infatti, sia per la JS, che per la PCH e DC, mutazioni nei
geni noti sono ad oggi identificabili soltanto in poco più della metà dei pazienti,
suggerendo ulteriore eterogeneità genetica.
Studi molecolari, bioinformatici e statistici sulla mole ingente di dati generati
dagli studi NGS sono ancora oggi in corso, al fine di individuare oltre alle
mutazioni patogenetiche, anche le eventuali varianti rare e polimorfismi che
potrebbero agire come modificatori genetici sulla penetranza ed espressività del
fenotipo clinico.
La sfida risulta quindi particolarmente rilevante in ambito clinico, col fine di poter
estrapolare dai dati genetici informazioni significative per migliorare condizioni
e di poter offrire alle famiglie un migliore counselling e la possibilità di effettuare
114
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