Estrazione della frazione lipidica dalla matrice

La caratterizzazione della frazione lipidica del latte comporta diversi passaggi chiave: l’estrazione della frazione grassa totale, la separazione e quantificazione delle varie classi lipidiche, la loro derivatizzazione, l’identificazione e la quantificazione degli acidi grassi che le compongono.

E’ evidente che dall’esito del passaggio iniziale di estrazione dipenderà quindi la qualità dei risultati ottenuti in tutte le fasi successive. Il metodo analitico utilizzato deve quindi essere in grado di estrarre i lipidi in modo quantitativo, qualora ne sia richiesta la determinazione totale; o quanto meno rappresentativo senza alterarne i reciproci rapporti ponderali, qualora ne sia richiesta la caratterizzazione in termini di costituenti.

Il metodo analitico di estrazione dovrebbe anche possedere i seguenti requisiti:

• capacità di inibire l’azione di enzimi come lipasi e fosfolipasi, in modo da evitare fenomeni di degradazione lipolitica della materia grassa durante l’analisi;

• capacità di limitare il più possibile i fenomeni autossidativi e di isomerizzazione dei doppi legami durante l’estrazione (indotti generalmente dall’impiego di elevate temperature e da solventi non idonei);

• capacità di estrarre in modo aspecifico tutti i costituenti della frazione lipidica; • capacità di separare i lipidi dai componenti a ridotta polarità (interferenti apolari)

Marco Caredda. Messa a punto e validazione di metodi analitici aspecifici online impieganti strumentazione a Trasformata di Fourier per la determinazione di macro e microanaliti in latte ovino. Tesi di dottorato in Scienze chimiche, Ciclo XXVI, Università degli studi di Sassari.

I metodi di estrazione della materia grassa si dividono in due categorie:

1. metodi ufficiali di riferimento 2. metodi non ufficiali o sperimentali

I metodi ufficiali sono metodi validati che derivano da una estesa sperimentazione volta a definirne le caratteristiche di accuratezza e precisione. Tali metodi sono stati messi a punto e validati, nella maggior parte dei casi, nell’ambito di gruppi di lavoro che fanno capo ad organizzazioni internazionali che riuniscono esperti del settore scientifico. Nel caso del latte e dei prodotti lattiero caseari la FIL-IDF (Fédération International de Laiterie – International Dairy Federation) e la ISO (International Standard Organization) sono le due organizzazioni internazionali che, con attività congiunta, provvedono allo sviluppo di metodi di analisi e di campionamento o norme di prodotto su latte e derivati. Tali norme hanno carattere volontario, ma vengono frequentemente recepite a livello nazionale o internazionale come norme ufficiali. Inoltre sia a livello nazionale che europeo, gruppi di esperti nominati dai Ministeri provvedono alla messa a punto di specifici metodi analitici. La scelta, da parte dell’analista, di applicare un metodo sperimentale o ufficiale può dipendere da molti fattori, ma deve necessariamente dare priorità a quest’ultimo, nel caso si tratti di un controllo analitico di tipo ufficiale [Antongiovanni, 2007].

I metodi ufficiali

Nell’ambito dei metodi ufficiali, spesso sono disponibili due norme, di cui una definita “metodo di riferimento” e l’altra “metodo di routine”. La prima è la metodica che deve essere applicata, necessariamente, in caso di controversie legali; la seconda è solitamente un metodo più rapido, applicabile in caso di maggiore numerosità dei campioni. Nel caso del latte è disponibile anche una norma che riporta le linee guida per l’utilizzo degli strumenti che operano nel medio infrarosso, per la valutazione dei principali costituenti del latte, tra cui anche il grasso.

- Determinazione quantitativa del contenuto in grasso – IDF 1D:1996/ISO1211:1999 “Milk – Determination of fat content- Gravimetric method (Reference method)”. Questa procedura consente la determinazione precisa del contenuto in materia grassa. Il tenore in materia grassa è determinato gravimetricamente mediante

estrazione della materia grassa da una soluzione ammoniaco-alcolica del latte con etere dietilico ed etere di petrolio, evaporazione dei solventi e pesata del residuo, secondo il principio del metodo di Röse-Gottlieb. Il metodo prevede l’idrolisi basica del latte che favorisce l’eliminazione dell’interazione dei lipidi con le proteine. I lipidi vengono successivamente estratti con etere etilico o etere di petrolio o una miscela dei due solventi. A causa delle elevate temperature raggiunte durante l’aggiunta dell’ammoniaca, il processo può causare fenomeni di idrolisi, di isomerizzazione o di ossidazione degli acidi grassi coniugati e dei fosfolipidi, alterandone quindi i mutui rapporti di concentrazione.

- Determinazione quantitativa del contenuto in grasso secondo il metodo Gerber – ISO 2446: 1976 “Determination of fat content (Routine method)”.

Questa norma riporta le indicazioni per la determinazione del contenuto in grasso del latte, con il metodo rapido che utilizza i butirrometri Gerber. Il principio del metodo si basa sulla separazione del grasso mediante centrifugazione del latte, dopo aver dissolto le proteine con acido solforico e favorito la separazione delle fasi con alcol isoamilico. La reazione avviene all’interno di un’apparecchiatura graduata (butirrometro) e fornisce direttamente la percentuale in materia grassa mediante lettura, su idonea scala, del livello di grasso limpido separato. Benché il metodo sia stato testato in differenti analisi interlaboratoriali, non sono ancora disponibili valori definitivi di precisione e di accuratezza, soprattutto in confronto al metodo gravimetrico di riferimento, a causa dei controversi risultati ottenuti con i diversi sistemi di misura dell’aliquota del campione da sottoporre ad analisi. E’ possibile infatti effettuare un prelievo in volume con pipette da 11 o da 10,77 ml, esprimendo quindi il risultato in p/v o pesando direttamente 11,13 ± 0,03g, esprimendo quindi il risultato in p/p. Poiché tale metodo è utilizzato in maniera routinaria, effettuare una pesata di tale accuratezza comporta necessariamente un notevole consumo di tempo e contrasta quindi con le peculiarità di questa procedura.

Nella pratica il metodo Gerber è comunemente utilizzato effettuando il prelievo con la pipetta da 11 ml. Bisogna comunque tener presente che, sia per le caratteristiche del metodo, sia per questa problematica di prelievo, i risultati possono leggermente differire dal metodo di riferimento sia in termini di accuratezza che in termini di precisione.

- Determinazione quantitativa del contenuto in grasso con apparecchiatura automatica – IDF 141C:2000/ISO 21543:1999 “Whole milk – Determination of milkfat, protein & lactose content – Guide for the operation of mid-infra-red instruments”.

Si tratta di una procedura automatica, non distruttiva, che utilizza la correlazione esistente tra l’assorbimento a specifiche lunghezze d’onda e il contenuto in macrocostituenti del latte, tra cui il grasso, per determinarne la concentrazione. La norma ufficiale non riporta i dettagli del procedimento analitico, in quanto può variare a seconda del tipo di strumento, ma indica delle linee guida applicabili a tutti i tipi di strumentazione. I dati di riferimento utilizzati per la costruzione dei modelli di predizione sono acquisiti tramite metodica IDF 1D:1996/ISO1211:1999. L’analisi, replicata in doppio, permette l’ottenimento del valore predetto nell’arco di pochi secondi senza alcun tipo di pretrattamento del campione. La metodica è validata su latte bovino ed applicabile al latte di altre specie animali.

- Metodo di estrazione del grasso e delle sostanze liposolubili – IDF172:2001/ISO 14156:2001 – “Milk and Milk products – Extraction methods for lipids and liposoluble compounds”.

Questa norma descrive le procedure idonee ad ottenere la separazione o l’estrazione di una quota rappresentativa della frazione lipidica del latte, nel caso in cui si debba procedere ad altre determinazioni dei singoli costituenti della materia grassa. L’estrazione effettuata con questo metodo prevede l’utilizzo di ammoniaca, etanolo, etere etilico e pentano. Il procedimento è lungo ed è specificamente applicabile nel caso si debba effettuare la valutazione della composizione in acidi grassi e trigliceridi, mentre non consente un recupero rappresentativo dei costituenti lipidici più polari, come ad esempio i fosfolipidi. Non consente inoltre l’estrazione degli acidi grassi liberi. Le procedure descritte non sono idonee ad ottenere un valore quantitativo del contenuto in grasso.

I metodi non ufficiali o sperimentali

- Metodo Röse-Gottlieb.

Il tenore in materia grassa è determinato gravimetricamente mediante estrazione della materia grassa da una soluzione ammoniaco-alcolica del latte con etere

dietilico ed etere di petrolio, evaporazione dei solventi e pesata del residuo, secondo il principio del metodo di Röse-Gottlieb.

- Metodo rapido per l’estrazione dei trigliceridi.

Il tenore in materia grassa è determinato gravimetricamente mediante estrazione della materia grassa da una soluzione ammoniaco-alcolica del latte con esano, evaporazione dei solventi e pesata del residuo, secondo Buccioni et al. [Buccioni, 2004].

- Metodo di Hara and Radin [Hara, 1978].

Il metodo di estrazione Hara Radin nasce originariamente per l’estrazione dei lipidi dai tessuti animali. Il metodo prevede l’utilizzo di una miscela di solventi esano/isopropanolo; l’alcol causa la dissociazione delle interazioni dei lipidi mentre il secondo solvente agisce da mezzo di estrazione. La miscela proposta ha una tossicità inferiore della miscela cloroformio/metanolo del classico metodo di estrazione Folch [Folch, 1957]. L’utilizzo del cloroformio può infatti provocare l’insorgenza di tumori, mentre il metanolo può indurre danni al sistema visivo. L’esano, pur essendo una neurotossina se utilizzato ad elevate concentrazioni, comunque nel normale utilizzo in laboratorio è considerato relativamente non tossico [Hara, 1978].

Il metodo è stato applicato con successo anche all’estrazione dei lipidi dal latte [Jiang, 1996] e dalla crema del latte [Chouinard, 1999].

- Metodo fisico [Murphy, 1990].

Il metodo non prevede l’utilizzo di solventi chimici per estrarre la materia grassa dal latte ma utilizza metodi fisici (shock termico e centrifugazione) per separare i lipidi tramite rottura fisica della membrana dei globuli di grasso. Il metodo prevede una preliminare separazione della materia grassa del latte tramite centrifugazione (30 min, 3000 rpm, 4°C). Sulla crema separata viene effettuato uno shock termico (60°C per 15 min) che induce la rottura della membrana dei globuli di grasso. La successiva centrifugazione (30 min, 3000 rpm, 37°C) consente il recupero della fase grassa. Il metodo, più veloce dei precedenti, non è adatto alla quantificazione del grasso totale presente nel latte ma ne estrae una quantità rappresentativa.

Nel documento Messa a punto e validazione di metodi analitici aspecifici online impieganti strumentazione a Trasformata di Fourier per la determinazione di macro e microanaliti in latte ovino (pagine 109-114)