Identificazione dei composti

Il composto che eluisce a tR = 2.9 min, avente uno spettro UV con assorbimento massimo a 210 nm e uno spettro di massa con uno ione molecolare deprotonato [M-H]ˉ a m/z 191 (PM = 192), è stato identificato come

Picco Composto tR (min) [M−H]− Picco base MS/MS (m/z) Ioni MS/MS (m/z) λmax (nm) 1 Acidi organici citric acid Acidi fenolici 2.9 191 111 129, 173, 87 210 6 acido 5-sinapoilchinico 21.7 397 235 191 253, 347 Flavoni C-glucosidi 2 vicenina-2 16.4 593 473 575, 503, 383, 353 272, 335

3 lucenina-2 4’-metil etere 17.6 623 503 605, 533, 413,

383 256, 271, 348 Flavanoni O-glicosidi 4 neoeriocitrina/ eriocitrina 19.7 595 459 287 284, 323 5 neoeriocitrina/ eriocitrina 20.5 595 459 441, 433, 357, 287, 235 284, 325 9 naringina 22.4 579 459 417, 313, 271 283, 329 10 non identificato 22.9 915 753 771, 609, 447 267, 337 11 neoesperidina 23.1 609 301 489, 447 284, 329 12 neodiosmina/ crisoeriolo 7-O-neoesperidoside 23.4 607 299 487, 443 253, 268, 345 3-Idrossi-3-metilglutaril flavanoni O-glicosidi 7 non identificato 22.0 901 757 839, 799, 677, 637, 595, 287 274, 340 8 non identificato 22.2 885 579 741, 661, 621 285, 326 13 non identificato 24.1 739 595 637, 677, 459 284, 325 14 melitidina 25.2 723 579 661, 621, 433, 417, 271 283, 326 15 brutieridina 25.6 753 609 691, 651, 447, 301 283, 325 Limonoidi glicosidi 16 glucoside dell’acido nomilinico 27.8 711 607 651, 549 210

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acido citrico (picco 1, Figura 11), grazie alla presenza dei tipici picchi di

frammentazione nello spettro ESI-MS/MS a m/z 173 [M-H-18]ˉ derivante dalla perdita di una molecola di H2O, 129 [M-H-44-18] ˉ, che corrisponde alla perdita

di una molecola di CO2 e una di H2O, e 111 [M-H-44-18-18]ˉ, dovuto alla perdita

di una molecola di CO2 e due di H2O.

Figura 12 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS dell’acido citrico

Acidi fenolici

Il composto che eluisce a tR = 21.7 min è l’acido 5-sinapoilchinico (picco 6, Figura 11) che presenta nello spettro ESI-MS uno ione molecolare deprotonato

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[M-H]ˉ a m/z 397 (PM = 398). Questo composto è caratterizzato da uno spettro di assorbimento UV con bande a lunghezze d’onda di 253 e 347 nm. Nello spettro ESI-MS/MS sono visibili picchi di frammentazione a m/z 235 [M-H-162]ˉ, dovuto alla perdita di una molecola di acido chinico, e 191 [M-H-206]ˉ derivante dalla perdita dell’acido sinapico.

Figura 13 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS dell’acido 5- sinapoilchinico

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Il composto che eluisce a tR = 16.4 min mostra uno spettro di assorbimento UV con bande a lunghezza d’onda di 272 e 335 nm. Lo spettro di massa presenta uno ione molecolare deprotonato [M-H]ˉ a m/z 593 (PM = 594) e picchi di frammentazione a m/z 575 [M-H-18]ˉ derivante dalla perdita di una molecola di H2O, 413 [M-H-162]ˉ dovuto alla perdita di una molecola di glucosio, 473 [M-H-

120]ˉ e 353 [M-H-240]ˉ tipici dei di-C-esosilflavoni (Mencherini et al., 2012). Pertanto, il composto è stato identificato come vicenina-2 (picco 2, Figura 11).

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La sostanza con tR = 17.6 min è stata identificata come lucenina-2,4’-

metiletere (picco 3, Figura 11), che possiede uno spettro UV con assorbimento

massimo a 256, 271 e 348 nm. Nello spettro di massa si osserva la presenza dello ione molecolare deprotonato a m/z 623 [M-H]ˉ (PM = 624), la cui frammentazione dà origine agli ioni m/z 443 [M-H-H2O-162]ˉ, dovuto alla perdita

di una molecola di acqua più una molecola di glucosio, e 503 [M-H-120]ˉ e 383 [M-H-240]ˉ, caratteristici dei flavoni C-glicosidi, come già osservato per la vicenina-2.

48 Figura 15 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS della lucenina-2,4’-metiletere

Flavanoni O-glicosidi

Al tR = 23.4 min, eluisce un composto che presenta lo ione molecolare deprotonato pari a m/z 607 [M-H]ˉ (PM = 608) e uno spettro di assorbimento UV a tre diverse lunghezze d’onda: 253, 268 e 345 nm. Nello spettro ESI-MS/MS si osservano picchi di frammentazione a m/z 461, generato dalla scissione di una molecola di ramnosio, e 299 [M-H-308]ˉ, dovuto alla perdita di una molecola di ramnosio e successivamente di un residuo di glucosio. Sulla base dei seguenti dati, il picco 12 (Figura 11) potrebbe corrispondere alla neodiosmin oppure al

crisoeriolo 7-O-neoesperidoside , che sono fra loro isomeri. Le strutture di

49 Figura 16 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS dei composti neodiosmina e

50 O R3 R2 R1 OH O R4 R5 Figura 17 Struttura dei flavoni C-glucosidi (2 e 3) e flavanoni O-glicosidi (12)

presenti nel succo di C. bergamia. I numeri assegnati a ciascun composto sono corrispondenti ai picchi in Figura 11.

I composti 4 e 5 (tR = 19.7 e 20.5 min, rispettivamente) sono caratterizzati da simili spettri di assorbimento a lunghezze d’onda di 284 e 323-325 nm. Gli spettri di massa presentano lo stesso ione molecolare deprotonato a m/z 595 [M-H]ˉ (PM= 596) e picchi di frammentazione a m/z 459 [M-H-136]ˉ (prodotti tramite retro-Diels-Alder sull’anello C del flavanone) e 287 [M-H-162-146]ˉ, dovuti alla perdita di una molecola di glucosio e una di ramnosio. A questi picchi potrebbero corrispondere la eriocitrina o la neoeriocitrina (picchi 4 e 5, Figura 11), ma mediante i dati a disposizione non è possibile assegnare con certezza i picchi corrispondenti all’uno o all’altro flavonoide.

Composto R1 R2 R3 R4 R5 Nome

2 Glucosio OH Glucosio H OH Vicenina-2

3 Glucosio OH Glucosio OH OMe Lucenina-2 4’-metil

etere

12 H O-Neoesperidosio H OMe OH Crisoeriolo 7-O- neoesperidoside

51 Figura 18 Spettri UV, MS e MS/MS della eriocitrina o della neoeriocitrina

52 Figura 19 Spettri UV, MS e MS/MS della eriocitrina o della neoeriocitrina

Al tr = 22.4 min eluisce un composto con spettro di assorbimento UV al

lunghezze d’onde pari a 283 e 329 nm, spettro di massa con ione molecolare deprotonato a m/z 579 [M-H]ˉ (PM= 580) corrispondente alla naringina (picco 9, Figura 11). La frammentazione dello ione [M-H]ˉproduce picchi a m/z 459 [M-H- 120]ˉ, tipico del nucleo flavonoidico, 441 [M-H-146]ˉ e 417 [M-H-162]ˉ, dovuti alla perdita rispettivamente di una molecola di ramnosio e una di glucosio.

53 Figura 20 Spettri UV, MS e MS/MS della naringina

Il composto che eluisce a tr = 23.1 min presenta uno spettro di massa con ione

molecolare deprotonato a m/z 609 [M-H]ˉ (PM = 610), corrispondente alla

neoesperidina (picco 11, Figura 11). Il massimo assorbimento UV si registra alle

lunghezze d’onda 284 e 329 nm. Nello spettro ESI-MS/MS si rivelano picchi di frammentazione a m/z 447[M-H-162]ˉ, dovuto alla perdita di una molecola di glucosio, e 301 [M-H-144-164]ˉ generato dalla perdita di una molecola di glucosio ed una di ramnosio.

54 Figura 21 Spettri UV, MS e MS/MS della neoesperidina

Le strutture dei composti 4, 5, 9, e 11 sono illustrate in Figura 24.

Flavanoni glicosidi coniugati all’acido 3-idrossi-3-metilglutarico

Il picco 14 (tR = 25.2 min, Figura 11).) è stato identificato come melitidina. Lo spettro UV presenta un assorbimento massimo a due diverse lunghezze d’onda

55

pari a 283 e 326 nm. Nello spettro ESI-MS è visibile lo ione molecolare deprotonato a m/z 723 [M-H]ˉ (PM = 724), il cui pattern di frammentazione mostra picchi a m/z 661 [M-H-44-18]ˉ corrispondente alla perdita di una molecola di CO2 e una di H2O, 621 [M-H-102]ˉ dovuto dalla perdita di [C4H6O3]ˉ,

579 [M-H-144]ˉ generato dalla scissione dell’acido 3-idrossi-3-metilglutarico, 433 [M-H-144-146]ˉ e 417 [M-H-144-162]ˉ derivanti rispettivamente dalla perdita di una molecola di ramnosio e successivamente di glucosio. La melitidina è un flavanone glicosilato il cui aglicone è la naringenina, esterificata con acido 3- idrossi-3-metilglutarico (Figura 24).

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Al tR = 25.6 min eluisce un composto con assorbimento massimo alle lunghezze d’onda di 283 e 325 nm, simile a quello della melitidina. Questi valori corrispondono al picco della brutieridina (picco 15, Figura 11) con PM = 754, come si deduce dallo ione molecolare deprotonato a m/z 753 [M-H]ˉ nello spettro di massa. Nello spettro ESI-MS/MS si osservano picchi di frammentazione a m/z

691 [M-H-44-18]ˉ corrispondente alla perdita di una molecola di CO2 e una di

H2O, 651 [M-H-102]ˉ dovuto alla perdita di [C4H6O3]ˉ, 609 [M-H-144]ˉ generato

dalla scissione dell’acido 3-idrossi-3-metilglutarico, e 447 [M-H-144-146]ˉ e 301 [M-H-144-162]ˉ, generati dalla perdita di una molecola di ramnosio e successivamente di glucosio. L’aglicone della molecola è la neoesperidina (Mencherini et al., 2012).

57 Figura 23 Spettri UV, MS e MS/MS della brutieridina

58 O R1 OH O R2 R3 Composto R1 R2 R3 Nome 4/5 O-Rutinosio OH OH Eriocitrina 4/5 O-Neoesperidosio OH OH Neoeriocitrina 9 O-Neoesperidosio H OH Naringina

11 O-Neoesperidosio OH OMe Neoesperidina

14 3-Idrossi-3-metilglutaril O-neoesperidosio H OH Melitidina 15 3-Idrossi-3-metilglutaril O-neoesperidosio OH OMe Brutieridina

Figura 24 Struttura dei flavanoni O-glicosidi presenti nel succo di C. bergamia

Limonoidi

Il composto che eluisce con tR = 27.8 min è stato identificato come glucoside

dell’acido nomilinico (picco 16, Figura 11), appartenente alla classe dei

limonoidi. Esso presenta PM = 712 con ione molecolare deprotonato nello spettro di massa a m/z 711 [M-H]ˉe picchi di frammentazione a m/z 651 [M-H- 60]ˉ dovuto alla perdita di una molecola di acido acetico, 607 [M-H-104]ˉ determinato dalla perdita di una residuo di acido acetico più una molecola di CO2, e 549 [M-H-162]ˉ, corrispondente alla perdita di una molecola di glucosio.

Lo spettro UV presenta il massimo assorbimento alla lunghezza d’onda di 210 nm. La struttura del glucoside dell’acido nomilinico è rappresentata in Figura 26

59 Figura 25 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS del glucoside dell’acido nomilinico

O O-Glucosio O COOH O HO OAc HOOC

60

I composti rappresentati dai picchi 7, 8, 10 e 13 (Tabella 1, Figura 11) non sono stati identificati in quanto non sono stati precedentemente riportati in C.

bergamia. Possiamo comunque ipotizzare la loro struttura facendo riferimento

agli spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS.

Il composto 7 a tR = 22.0 min presenta uno spettro di assorbimento UV alle lunghezze d’onda di 274 e 340 nm. Nello spettro di massa si osserva lo ione molecolare deprotonato [M-H]ˉ a m/z 901, da cui si può dedurre il peso molecolare, pari a 902 u. L’analisi del pattern di frammentazione dello ione [M- H]ˉ mostra picchi a m/z 757 [M-H-144]ˉ, generato dalla perdita dell’ acido 3- idrossi-3-metilglutarico e a m/z 595, risultante dalla perdita di un residuo dell’acido 3-idrossi-3-metilglutarico, seguito da una molecola di un esoso [M-H- 144-162]ˉ (probabilmente glucosio). Il picco base a m/z 595 può essere attribuito alla eriocitrina o alla neoeriocitrina, due flavanoni O-glicosidi isomeri precedentemente riportati nel succo di C. bergamia ( Gattuso et al., 2007). Pertanto, il composto 7 sembrerebbe essere costituito dall’eriocitrina o dalla neoeriocitrina a cui sono legati un residuo di acido 3-idrossi-3-metilglutarico e una molecola di glucosio.

61 Figura 27 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS del composto 7

Uno spettro di frammentazione MS/MS simile si osserva nel caso del composto 8 (tR = 22.2 min) che presenta uno ione molecolare deprotonato a m/z 885 [M-H]ˉ (PM= 886) e picchi di frammentazione a m/z 741 [M-H-144]ˉ e 579 [M-H-144-162]ˉ, tali da far supporre che il composto 8 possa essere la naringina o la narirutina ([M-H]ˉ a m/z 579) recante una molecola di acido 3-idrossi-3- metilglutarico e un esoso (probabilmente glucosio). Lo spettro UV mostra assorbimento massimo a due lunghezze d’onda, 285 e 326 nm, osservato anche negli altri flavanoni.

62 Figura 28 Spettri UV, ESI-MS e ESI-MS/MS del composto 8

Il composto 13 eluisce a tR = 24.1 min e presenta assorbimento massimo alle lunghezze d’onda di 284 e 325 nm, indicando la presenza di un flavanone. Nello spettro di massa lo ione molecolare deprotonato [M-H]ˉ presenta un picco corrispondente a m/z 739 (PM = 740), mentre i picchi di frammentazione si osservano a m/z 595 [M-H-144]ˉ, probabilmente dovuto alla perdita di una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico, 577 [M-H-162]ˉ generato dalla scissione di un esoso (probabilmente glucosio), 433 [M-H-144-162]ˉ,

63

determinato dalla perdita di una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico e di un esoso, 287 [M-H-144-308]ˉ, attribuibile allo ione che ha subito la perdita di una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico, una molecola di glucosio e una di ramnosio. Il picco base a m/z 595 potrebbe essere attribuito alla eriocitrina o

neoeriocitrina, due flavanoni O-glicosidi isomeri, precedentemente determinati

nel succo di C. bergamia. Pertanto, il composto 13 sembrerebbe essere costituito da una molecola di eriocitrina o neoeriocitrina legata a un residuo di acido 3- idrossi-3-metilglutarico, un glucosio e un ramnosio.

64

Al tR = 22.9 min eluisce il composto 10, con uno spettro di assorbimento UV alle lunghezze d’onda di 267 e 337 nm. Nello spettro ESI-MS/MS esso presenta uno ione molecolare deprotonato a m/z 915 [M-H]ˉ (PM = 916) e picchi di frammentazione a m/z 771 [M-H-144]ˉ, originato dalla perdita di una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico, 609 [M-H-144-162]ˉ, probabilmente derivante dalla perdita di acido 3-idrossi-3-metilglutarico al quale è legato un residuo di esoso (probabilmente glucosio), 447 [M-H-144-162-162]ˉ, derivante dalla perdita di una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico e due esosi. L’analisi di questi dati induce a ipotizzare che il composto 10 sia la neoesperedina legata a una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico e due molecole di glucosio.

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Riassumendo, i composti di nostro interesse identificati mediante l’analisi HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS sono: acido citrico e acido 5-sinapoilchinico; tre C- glucosilflavoni, vicenina-2, lucenina-2,4’-metiletere, neodiosmina/crisoeriolo 7-

O-neoesperidoside; quattro flavanoni O-glicosidi, eriocitrina, neoeriocitrina,

naringina, neoesperidina; due flavanoni O-glicosidi coniugati all’acido 3-idrossi-3- metilglutarico, ovvero melitidina e brutieridina; un limonoide, il glucoside dell’acido nomilinico. Inoltre, quattro composti rimangono non identificati, ma dall’analisi degli spettri UV e ESI-MS essi sono attribuibili alla classe dei flavanoni

O-glicosidici, recanti in tre casi una molecola di acido 3-idrossi-3-metilglutarico.

Sono necessari ulteriori studi per confermare la presenza di questi derivati nel succo di C. bergamia e le loro esatte strutture.