Gli animali che sono stati trattati con dieta HFc per 21 giorni, hanno mostrato un intake di acqua e cibo sovrapponibile a quello tipico degli animali allevati con dieta standard (STD). Anche per quanto riguarda i ratti trattati con dieta ad alto contenuto lipidico con aggiunta di bergamotto (HFc+B) sia al 6%v/v che al 12% v/v, l’intake di cibo e acqua risulta sovrapponibile (Figura 31; Figura 32).
66 Figura 31 Intake di acqua dei ratti trattati nei 21 giorni. Le barre verticali
indicano l’errore standard
Figura 32 Intake di cibo nei ratti sottoposti, nei 21 giorni, ai diversi
trattamenti indicati. Le barre verticali indicano l’errore standard
Il trattamento HFc, come riportato in letteratura (Lozano et al.,2016), produce un incremento significativo del peso corporeo se confrontato con animali alimentati con dieta standard.
L’aggiunta del succo di bergamotto al 6% v/v nell’acqua da bere, non ha prodotto alcuna variazione dell’incremento del peso corporeo; di fatto per quanto riguarda i ratti trattati con HFc + B al 6% v/v mostrano un aumento di
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peso rispetto ai ratti trattati con dieta STD. Un comportamento diverso si ha quando ai ratti trattati con dieta HFc viene aggiunta una percentuale doppia di succo di bergamotto, ossia al 12% v/v. Questi ultimi presentano un incremento del peso corporeo, rispetto al precedente, sovrapponibile a quello degli animali trattati con dieta STD. Infatti, se si confronta l’aumento del peso corporeo dei ratti HFc con i ratti HFc + B 12%, si osserva una riduzione significativa nella crescita corporea (Figura 33)(tabella 2), suggerendo che l’aggiunta del succo di bergamotto alla dieta di questi animali possa avere interessanti effetti sul metabolismo lipidico.
Figura 33 Incremento percentuale del peso dei ratti trattati con le diete STD,
HFc, HFc+B 6%, HFc+B 12% i cui valori sono riportati in tabella 2. Le barre verticali indicano l’errore standard, il simbolo (*) indica un valore significativamente diverso dal controllo al 21° giorno [* p<0.05] e (ns) indica l’assenza di significatività tra STD e HFc+B 12%. Le barre verticali indicano l’errore standard
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PESO INIZIALE PESO 21°
GIORNO INCREMENTO % STD 307.5 ± 5.5 327.5 ± 4.5 6.5%* HFc 334 ± 9.0 364.8 ± 9.8 9.35% HFc+B 6% 316.3 ± 8.4 345 ± 4.8 9.26% HFc+B 12% 335.16 ± 5.3 351.8 ± 1.7 5.13%*
Tabella 2 Incremento ponderale nelle diete STD, HFc, HFc+B 6%, HFc+B 12%. Il
simbolo ± indica l’errore standard.
Per quanto riguarda l’analisi dei parametri cardiometabolici, si osserva che il trattamento con una dieta ricca di grassi produce un incremento dei parametri lipidici; in particolare si osserva un aumento significativo sul colesterolo LDL e non-HDL; un aumento, sebbene non significativo, di trigliceridi e colesterolo totale. In linea con quanto atteso, elevati livelli di colesterolo producono una riduzione dei livelli di HDL. Il tutto si riflette con un aumento del rischio cardiovascolare, come dimostrato dall’incremento del rapporto tra colesterolo totale e colesterolo HDL.
Il trattamento con succo di bergamotto, sia al 6% v/v che al 12% v/v, non determina effetti significativi sui valori del colesterolo totale, del colesterolo LDL e del colesterolo non-HDL. E’ tuttavia importante osservare come l’ipercolesterolemia riscontrata in questo modello sperimentale sia indotta da un ingente apporto di colesterolo introdotto con la dieta piuttosto che da un alterato metabolismo endogeno. Pertanto è ragionevole ritenere che eventuali effetti ipocolesterolemici basati su meccanismi d’azione inibitori nei confronti dei processi di produzione endogena, per altro già proposti per il bergamotto (Mollace et al., 2011), potrebbero risultare poco efficaci.
Ciò nonostante, è comunque interessante osservare che il succo di bergamotto, ad entrambi i dosaggi somministrati, porta ad un incremento dei
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livelli di HDL (Figura 34)(Tabelle 3 e 4). Di fatto, l’impatto su questo parametro, determina un significativo contributo positivo sul rischio cardiovascolare che si riassesta su valori paragonabili a quelli determinati negli animali trattati con dieta STD (Figura 35)(Tabella 5). Un altro risultato importante è l’effetto dell’aggiunta di succo di bergamotto al 12% v/v sui trigliceridi. Per quanto le variazioni non siano significative, si osserva una chiara tendenza alla riduzione di questo parametro cardiometabolico rispetto a quanto osservato negli animali trattati con dieta HFc (Figura 34)(Tabella 3 e 4).
Figura 34 Istogrammi relativi ai livelli plasmatici (mg/dl) di LDL, HDL,
colesterolo non-HDL e trigliceridi degli animali trattati con le diete STD, HFc, HFc+B 6% e HFc+B 12% al 21° giorno, i cui valori sono riportati in tabella 3 e 4. Il simbolo (*) indica un valore significativamente diverso da STD [* p<0.05]; (°) indica un valore significativamente diverso da HFc. [° p<0.05]. Le barre verticali indicano l’errore standard
70 LDL HDL Non HDL STD 25.25 ± 3.4 45.5 ± 11.2 38.7 ± 3.49 HFc 54.9 ± 3.1*** 35.9 ± 4.0 70.58 ± 3.2*** HFc+B 6% 47.0 ± 3.35*** 53.3 ± 3.39° 62.8 ± 2.8*** HFc+B 12% 52.3 ± 4.0*** 50.5° ± 1.6 70.16 ± 3.9***
Tabella 3 Parametri di colesterolemia (media ± errore standard) misurati
dopo un trattamento di 21 giorni nei tre gruppi alimentati con le varie diete ed espressi in mg/dl. Il simbolo ± indica l’errore standard. Il simbolo ± indica l’errore standard.
TRIGLICERIDI COLESTEROLO TOT
STD 68.2 ± 9.8 84.25 ± 10.1 HFc 78.5 ± 5.1 106.4 ± 4.35* HFc+B 6% 77.8 ± 7.8 116.1 ± 3.4* HFc+B 12% 64.3 ± 2.4° 120.5 ± 2.9**°
Tabella 4 Valori medi colesterolemici misurati in mg/dl dopo un trattamento
di 21 giorni nei tre gruppi alimentati con le varie diete. Il simbolo ± indica l’errore standard
71 Figura 35 Istogrammi relativi al rapporto colesterolo totale/HDL nelle diete
STD, HFc, HFc+B 6% e HFc+B 12% al 21° giorno, i cui valori sono riportati in tabella 5. Il simbolo (°) indica un valore significativamente diverso da HFc al 21° giorno. [° p<0.05]. Le barre verticali indicano l’errore standard
COL/HDL
STD 2.12 ± 0.4
HFc 3.28 ± 0.2*
HFc+B 6% 2.23 ± 0.11°
HFc+B 12% 2.4 ± 0.11°
Tabella 5 Valori di colesterolo totale/HDL misurati dopo 21 giorni nelle varie
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Per quanto riguarda l’analisi degli organi prelevati alla fine del trattamento cronico ai due diversi dosaggi, sul fegato non si sono registrate variazioni nella massa ponderale per nessuno dei diversi tipi di trattamento eseguiti.
L’osservazione macroscopica e l’analisi microscopica eseguita utilizzando la tecnica Oil-red, in grado di evidenziare accumuli di grasso a livello dei tessuti, rilevano che l’alimentazione con dieta HFc genera un marcato aumento dei depositi di grasso di questo organo, il quale non viene significativamente influenzato dal trattamento col succo di bergamotto (Figura36; 36a; 36b)(Tabella 6).
Figura 36 Istogrammi rappresentativi del rapporto tra il peso del fegato e il
peso corporeo dell’animale dopo 21 giorni, per le diete STD, HFc, HFc+B 6%, HFc+B 12%, i cui valori sono riportati in tabella 6. Le barre verticali indicano l’errore standard
73 g fegato/Kg animale STD 22.79 ± 0.67 HFc 24.69 ± 0.75 HFc+B 6% 23.7 ± 0.8 HFc+B 12% 23.37 ± 0.4
Tabella 6 Valori medi del rapporto tra il peso del fegato e il peso dell’animale
misurati dopo 21 giorni, per gli animali trattati con le varie diete. Il simbolo ± indica l’errore standard
Figura 36a Immagini macroscopiche del fegato nelle diete STD, HFc, HFc+B
6% e HFc+B 12% HFc+B 12% STD HFc HFc+B 6% HFc+B 12%
74 Figura 36b Immagini istologiche del fegato trattato con le diete STD, HFc,
HFc+B 6% e HFc+B 12%
Per quanto riguarda l’osservazione macroscopica del cuore, è stato possibile osservare che la dieta HFc ha prodotto una certa tendenza all’ipertrofia miocardica, evidenziata da un aumento ponderale che comunque non raggiunge i livelli di significatività statistica. Negli animali trattati con il trattamento HFc + B 12% la massa cardiaca è risultata sovrapponibile a quella degli animali trattati con dieta STD, suggerendo che quindi il bergamotto possa aver esercitato un effetto preventivo sullo sviluppo di ipertrofia (Figura 37)(Tabella 7). In futuro verranno effettuate analisi istologiche per comprendere se eventuali processi fibrotici siano evidenti.
STD
HFc
75 Figura 37 Istogrammi rappresentativi del rapporto tra il peso del cuore e il
peso corporeo dell’animale dopo 21 giorni, per le diete STD, HFc, HFc+B 6%, HFc+B 12%, come riportato in tabella 7. Il simbolo (°) indica un valore significativamente diverso da HFc. Le barre verticali indicano l’errore standard
g cuore/ Kg animale
STD 3.5 ± 0.18
HFc 4.08 ± 0.18
HFc+B 6% 3.8 ± 0.2
HFc+B 12% 3.57 ± 0.12°
Tabella 7 Valori del rapporto tra il peso del cuore e il peso dell’animale nelle
varie diete. Il simbolo ± indica l’errore standard
Successivamente siamo passati ad analizzare il grasso viscerale. Come atteso, sulla base dei dati riportati in letteratura su questa tipologia di dieta (McCommis
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et al., 2011), l’alimentazione degli animali con dieta HFc genera un incremento della massa grassa viscerale e l’aggiunta di succo di bergamotto a questa dieta genera una diminuzione di questo parametro, che diventa significativa al dosaggio di 12% v/v. Tale risultato è in linea con quanto osservato dall’incremento del peso corporeo, suggerendo che l’integrazione di succo di bergamotto al 12% v/v è in grado di influenzare, secondo un meccanismo che deve ancora essere compreso, il metabolismo lipidico e di conseguenza l’accumulo di grassi (Figura 38)(Tabella 8).
Figura 38 Istogrammi rappresentativi del rapporto tra il peso del grasso
viscerale e il peso corporeo dell’animale dopo 21 giorni, per le diete STD, HFc, HFc+B 6%, HFc+B 12%, come riportato in tabella 8. Il simbolo (°) indica un valore significativamente diverso da HFc [° p<0.05]. Il simbolo (*) indica un valore significativamente diverso da STD [* p<0.05]. Le barre verticali indicano l’errore standard
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G grasso viscerale/ Kg animale
STD 24.79 ± 1.89
HFc 35.39 ± 2.8*
HFc+B 6% 30.2 ± 1.35
HFc+B 12% 28.2 ± 1.0°
Tabella 8 Valori del rapporto tra il peso del grasso viscerale misurati e il peso
dell’animale misurati dopo 21 giorni, nelle varie diete. Il simbolo ± indica l’errore standard.
La condizione di ipercolesterolemia è considerata una situazione in cui il soggetto è più sensibile al danno da ischemia da riperfusione miocardica. È stato riportato in letteratura che la stessa condizione produce nell’animale ipercolesterolemico un danno maggiore rispetto al normocolesterolemico (Nan et al., 2015; Nan et al., 2015). E’ stato inoltre proposto che l’ipercolesterolemia influenzi la funzione mitocondriale e, in particolare, renda i mitocondri (organelli che proteggono il miocardio dall’insulto ischemico) più vulnerabili (McCommis et al., 2011). Alla luce di questi dati di letteratura, un ulteriore obiettivo della tesi è stato quello di valutare l’effetto del trattamento con Citrus bergamia sul potenziale di membrana mitocondriale. Tale parametro è molto interessante in quanto è indicativo della funzione del mitocondrio. In condizioni normali, i mitocondri hanno un potenziale di circa -180 mV, tale valore garantisce che gli scambi degli elettroliti con il citosol della cellula avvengano in maniera efficiente e garantisce la fosforilazione ossidativa, condizioni necessarie per l’omeostasi cellulare. Il valore del potenziale di membrana dei mitocondri derivanti dal tessuto cardiaco al termine di questi trattamenti, mette in evidenza una significativa depolarizzazione del potenziale mitocondriale. Vediamo che per quanto riguarda il trattamento STD il potenziale risulta essere -174 mV, mentre nel trattamento con dieta HFc depolarizza a -161 mV. L’aggiunta di bergamotto
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non migliora questo parametro. Tuttavia, è anche possibile ipotizzare che i tempi di trattamento non siano in grado di ripristinare completamente la funzionalità mitocondriale, suggerendo come prospettiva sperimentale futura il ricorso a protocolli più prolungati, finalizzati ad investigare più specificatamente questo aspetto (Figura 39).
Figura 39 Istogrammi rappresentativi della differenza di potenziale nelle
diete STD, HFc, HFc+B 6% e HFc+B 12% al 21° giorno di trattamento, come riportato in tabella 9. Il simbolo (*) indica un valore significativamente diverso da STD [* p<0.05]. Le barre verticali indicano l’errore standard
Infine, un ultimo approccio sperimentale di particolare interesse è stato rivolto alla comprensione degli effetti del bergamotto su importanti marker di infiammazione a livello cardiaco, tramite l’analisi della concentrazione delle citochine pro-infiammatorie (TNF-α e IL-6) nel tessuto miocardico nei gruppi di animali sottoposti ai vari protocolli sperimentali. In particolare, la dieta HFc ha portato ad un marcato incremento dei livelli delle due citochine, che risultano almeno triplicati rispetto a quanto osservato negli animali trattati con dieta STD (Figura 40 e 41)(Tabella 9). Come evidente dai livelli di TNF-α e IL-6 osservati nel miocardio degli animali trattati con dieta HFc + B12% (significativamente ridotti
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rispetto a quelli riscontrati nella dieta HFc e quasi completamente “ricondotti” ai livelli determinati nella dieta STD), è possibile ipotizzare che il bergamotto abbia esercitato un importante effetto antiinfiammatorio.
Figura 40 Istogrammi relativi alle concentrazioni di TNF-α nei trattamenti con
dieta STD, HFc e HFc+B 12% al 21° giorno di trattamento, come riportato in tabella 9. Il simbolo (*) indica un valore significativamente diverso da STD [* p<0.05]. Il simbolo (°) indica un valore significativamente diverso da HFc [° p<0.05]. Le barre verticali indicano l’errore standard
80 Figura 41 Istogrammi relativi alle concentrazioni di Interleuchina-6 nei
trattamenti con dieta STD, HFc e HFc+B 12% al 21° giorno di trattamento, come riportato in tabella 9. Il simbolo (*) indica un valore significativamente diverso da STD [* p<0.05]. Il simbolo (°) indica un valore significativamente diverso da HFc [° p<0.05]. Le barre verticali indicano l’errore standard
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Concentrazione cardiaca IL-6 (pg/ml)
STD HFc HFc+B 12%
26.3 ± 4.8 68.7 ± 8.9* 49.5 ± 6.7°
Concentrazione cardiaca TNF-α (pg/ml)
STD HFc HFc+B 12%
9.6 ± 2.6 38.5 ± 5.3* 22.6 ± 3.3°
Tabella 9 Concentrazione cardiaca di TNF-α e Interleuchina-6 nelle varie diete.
Il simbolo ± indica l’errore standard. Il simbolo ± indica l’errore standard.