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Università di Pisa
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Magistrale in Farmacia
TESI DI LAUREA
VALUTAZIONE PRECLINICA NEL RATTO DEGLI EFFETTI DEL
TRATTAMENTO CRONICO CON SUCCO DI BERGAMOTTO
(CITRUS X BERGAMIA FAM. RUTACEAE) SUI PARAMETRI
CARDIOMETABOLICI E PONDERALI
Relatori:
Prof. Vincenzo Calderone
Dott.ssa Lara Testai
Correlatore:
Dott.ssa Marinella De Leo
Candidata:
Ilaria Costanzo
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A chi mi ha insegnato a ballare anche sotto la pioggia
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Sommario
CAPITOLO 1………....………..5
Introduzione………...……….5
1.1 Generalità dei frutti Citrus ………...……….….5
1.2 Citrus bergamia..……….…………..……..…...………6
1.2.1 Cenni di botanica ………...………6
1.2.2 Preparazioni ………...…..………...6
1.2.3 Costituenti rilevati all’interno dei frutti di Citrus bergamia...7
1.3 Caratteristiche chimiche di flavonoidi e limonoidi …..…….………10
1.3.1 Caratteristiche chimiche dei flavonoidi ……….…….10
1.3.2 Caratteristiche chimiche dei limonoidi ………11
1.4 Proprietà farmacologiche dei flavonoidi……….………….……….13
1.5 Proprietà farmacologiche dei limonoidi………….……….…..20
1.6 Scopo della ricerca……….………29
CAPITOLO 2 ……….………..31
Materiali e metodi ……….………..31
2.1 Preparazione del campione ………….………..31
2.2 Analisi HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS……….……….31
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2.4 Primo trattamento……….……….……….32
2.5 Secondo trattamento ………..………..33
2.6 Protocollo sperimentale……….………..34
2.7 Protocollo di isolamento dei mitocondri cardiaci ……….…………..34
2.7.1 Valutazione delle variazioni del potenziale mitocondriale …36
2.8 Analisi dei dati……….………...37
2.9 Tecnica di colorazione Oil Red O ……….38
2.10 Analisi delle citochine……….………….………38
2.11 Soluzioni ………38
CAPITOLO 3 ………..……….42
Risultati e discussione ...42
3.1 Parte fitoterapica……….……….42
3.1.1 Analisi HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS ……….…………. 42
3.1.2 Identificazione dei composti ………..……….43
3.2 Parte farmacologica ………66
3.3 Conclusioni ……….82
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CAPITOLO 1
Introduzione
1.1 Proprietà dei frutti del genere Citrus
I frutti delle piante appartenenti al genere Citrus sono di varie forme e dimensioni. Presentano delle caratteristiche tali da essere utilizzati nell’alimentazione, nella produzione dei cosmetici e nell’industria farmaceutica, rispettivamente come additivi e spezie, ingredienti per cosmetici e farmaci chemioprofilattici (He et al., 2011; Kelebek, Selli, 2011).
I frutti, infatti, rappresentano una buona risorsa per l’alimentazione, per l’alto contenuto in vitamina C e macronutrienti (Economos et al.,1999).
All’interno del frutto sono inoltre presenti metaboliti secondari, detti anche fitocostituenti, che non sono strettamente necessari per la sopravvivenza della pianta, ma sono importanti per la loro attività farmacologica. Tra questi troviamo: flavonoidi, alcaloidi, cumarine, limonoidi, carotenoidi, acidi fenolici e
oli essenziali.
Questi metaboliti secondari mostrano diverse bioattività di notevole importanza per la salute umana, inclusi effetti antiossidanti, antinfiammatori, anti-cancro, cardioprotettivi, neuroprotettivi. Per tali proprietà, i frutti sono utilizzati come rimedi medicinali in vari continenti asiatici (Commitee, 2010).
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1.2 Citrus bergamia
1.2.1 Cenni di Botanica
Citrus bergamia, comunemente chiamato bergamotto, è una pianta
appartenente alla famiglia delle Rutaceae. Le origini botaniche e geografiche del bergamotto sono incerte; potrebbe essere una pianta endemica della Calabria oppure potrebbe originare dalla Grecia, dalle Antille o dalle Isole Canarie (Rapisarda, Germanò, 2013; Navarra et al., 2015). Alcuni botanici hanno considerato il bergamotto come un ibrido derivato dalla limetta dolce e dall’arancio amaro, con il quale condivide alcuni caratteri. Attualmente, prevale la convinzione che si tratti di una specie a sé, forse frutto di un innesto casuale, definita dai botanici con il nome di Citrus bergamia Risso et Poiteau. Tre sono le principali cultivar di questo albero:
- Castagnaro; - Femminello; - Fantastico.
I frutti sono tondeggianti, qualche volta sferici, con buccia spessa che va dal verde al giallo con il progredire della maturazione. Essi sono costituiti da una parte esterna denominata epicarpo o flavedo, una parte sottostante chiamata
mesocarpo o albedo e da una parte interna detta endocarpo o polpa, che
rappresenta il 65-70% del frutto. Il bergamotto comincia a fiorire nel corso degli ultimi giorni di marzo, nelle località soleggiate prossime al mare e per tutto aprile nelle zone più interne. La maturazione varia da novembre a marzo (Mangiola, Polimeni, 1997).
1.2.2 Preparazioni
Le preparazioni che possono essere ottenute da C. bergamia sono l’olio essenziale e il succo. Il primo è un olio volatile ottenuto tramite pelatura e pressione a freddo della buccia del frutto. A causa della sua intensa fragranza, è
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largamente utilizzato nella profumeria e nella cosmetica così come nell’alimentazione. Inoltre, uno studio condotto da Costa e collaboratori (2010) ha dimostrato che nella medicina popolare era utilizzato per curare vari sintomi tra cui infezioni della bocca, della pelle, del sistema respiratorio e del tratto urinario (Pendino, 1998). L’olio essenziale è usato anche nell’industria farmaceutica come correttore del sapore di prodotti medicinali, anche se la sua maggiore applicazione si ha nell’aromaterapia (Navarra et al., 2015), dove è stata osservata la sua attività nel minimizzare i sintomi del disturbo dell’umore, dell’ansia indotta da stress (Halcon, 2002) e nel facilitare l’induzione del sonno (Wiebe, 2000). Recentemente l’olio di bergamotto è stato sperimentalmente studiato per la sua capacità antiproliferativa (Celia et al., 2013; Navarra et al., 2015) e neuroprotettiva (Corasaniti et al., 2007).
Per quanto riguarda il succo di bergamotto, ottenuto dall’endocarpo del frutto, c’è stato un accrescimento di interesse da parte delle case farmaceutiche per i composti bioattivi antiossidanti e il loro ruolo nella dieta. Il succo di bergamotto presenta proprietà ipolipidemiche, ipoglicemiche (Mollace et al., 2011), antiossidanti (Ferlazzo et al., 2015; Ferlazzo et al., 2016a, 2016b), antinfiammatorie (Risitano et al., 2014; Impellizzeri et al., 2015; Currò et al., 2016; Impellizzeri et al., 2016) e antitumorali (Delle Monache et al., 2013; Navarra et al., 2014; Visalli et al., 2014; Ferlazzo et al 2016b).
1.2.3 Costituenti attivi rilevati all’interno dei frutti di Citrus bergamia
In uno studio condotto da Russo et al. (2016) è stata analizzata la composizione quantitativa e qualitativa dei fitochimici presenti nei frutti di Citrus
bergamia di due differenti cultivar (Femminello e Fantastico), prendendo in
considerazione vari campioni corrispondenti a buccia, polpa, semi e succo. Ciò è stato possibile tramite l’utilizzo di una cromatografia liquida ad alta prestazione, in combinazione con un rivelatore UV e uno spettrometro di massa.
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Entrambe le cultivar hanno mostrato un profilo quantitativo e qualitativo di principi attivi molto simile. I campioni analizzati contenevano le seguenti classi di composti: flavonoidi, limonoidi, acidi fenolici e composti eterociclici dell’ossigeno tra cui le cumarine (Figura 1).
Figura 1 Composizione qualitativa e quantitativa di tutti i campioni
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Dai risultati ottenuti è possibile notare che i flavonoidi rappresentano la classe di composti più abbondante, seguita da quella dei limonoidi. Entrambi si trovano sia in forma agliconica che in forma glicosidica. La prima è insolubile in acqua, mentre la seconda è solubile in acqua. Questa natura influenza anche la distribuzione nelle varie parti del frutto (Figura 2).
Figura 2 Composizione percentuale delle molecole bioattive (A) e dei limonoidi
glucosidici e agliconici (B) contenuti nei campioni analizzati (Russo et al., 2016)
Il più alto contenuto di limonoidi, sia glicosidici che agliconici, si trova nei semi, in cui si ha anche il più alto contenuto di acidi fenolici. Le bucce contengono la più alta quantità di flavonoidi, mentre nelle polpe si ritrovano soprattutto composti eterociclici ossigenati. Inoltre le bucce sono l’unica parte del frutto che contiene i polimetossiflavoni: Sinensetina, Nobiletina, Tangeretina, Eptametossiflavone e Tetra-O-metilscutellarene (Russo et al., 2016).
Diversamente dagli altri succhi del genere Citrus, il bergamotto non ha un sapore gradevole e conseguentemente è difficile commercializzarlo, ma il succo
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di bergamotto estratto dalle due cultivar analizzate (Fantastico e Femminello) può essere facilmente concentrato ed essere usato per isolare flavonoidi (Russo et al., 2015) e limonoidi glucosidici, che possono essere usati come antiossidanti in differenti preparazioni di cibi funzionali o come nutraceutici purificati.
1.3 Caratteristiche chimiche di flavonoidi e limonoidi
1.3.1 Caratteristiche chimiche dei flavonoidi
I flavonoidi rappresentano la classe di composti principalmente presente nei frutti del genere Citrus. Approssimativamente il 95% è costituito dai flavanoni, mentre i flavoni, i flavonoli ed i flavoni polimetossilati sono presenti in quantità inferiore, circa il 5%. Inoltre, sono presenti in forma di glicosidi e agliconi anche se la forma predominante è la prima, nella quale l’aglicone è legato ad una molecola di uno o più zuccheri (Chen, Montanari, 1997).
Chimicamente i flavonoidi sono costituiti da uno scheletro di 15 atomi di carbonio, composto da due anelli benzenici A e B, legati ad un anello piranico eterociclico C (Figura 3).
Figura 3 Scheletro flavonoidico (Middleton, 1998)
Le varie sottoclassi di tali composti, identificate nel succo di bergamotto (Gardana et al., 2008), si differenziano per il livello di ossidazione, per il tipo di
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sostituzione dell’anello C e per la presenza o meno del gruppo ossidrilico in posizione 4’( Middleton, 1998).
Figura 4 Struttura dei flavonoidi identificati nel succo di bergamotto (Gardana
et al., 2008).
1.3.2 Caratteristiche chimiche dei limonoidi
I limonoidi identificati nel genere Citrus sono una famiglia di metaboliti secondari policiclici appartenenti alla classe dei terpeni. Questi sono prodotti naturali strutturalmente derivanti dalla polimerizzazione di unità isopreniche (Patil et al., 2006). I due elementi costitutivi dell’isoprene, l’isopentenil pirofosfato (IPP) e il dimetilallil pirofosfato (DMAPP), polimerizzano per formare un precursore triterpenico come quello dello squalene. Così, sei unità isopreniche sono necessarie a formare il triterpene squalene, il più vicino
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biosinteticamente all’idrocarburo relativo ai limonoidi. Il trattamento di tale scheletro triterpenico, attraverso reazioni di ciclizzazione, aromatizzazione, riarrangiamento e ossigenazione può dare origine a circa 200 differenti sottogruppi, incluso il sottogruppo dei limonoidi (Giles, 1999).
Figura 5 Struttura dei principali limonoidi nella forma agliconica. Questi
composti sono caratterizzati dalla condensazione di quattro anelli, strutturalmente simili agli steroidi, denominati A ,B ,C e D (Heasley, 2011).
13 1.4 Proprietà farmacologiche dei flavonoidi
- Attività protettiva cardiovascolare e antiiperglicemica
Vari studi dimostrano una riduzione della mortalità da danno cardiovascolare associata all’aumento del consumo di cibi ricchi di flavonoidi; si ipotizza che tali effetti benefici siano correlati alla riduzione dei livelli lipidici e glicemici e al miglioramento delle funzioni vascolari (Mink et al., 2007).
Studi clinici e preclinici dimostrano l’esistenza di una correlazione tra il consumo di flavonoidi e la riduzione dell’incidenza dell’ipertensione correlata a disfunzione endoteliale, la cui integrità e reattività sono mantenute dalla sintesi di mediatori come l’ossido nitrico (NO) e l’NO sintasi endoteliale. La ridotta attività di queste sostanze porta alla liberazione delle specie reattive dell’ossigeno e conseguenti complicanze cardiovascolari (Bleakley et al., 2015). A questo scopo è stato osservato che l’assunzione di Naringina ed Esperidina provoca una significativa riduzione della pressione diastolica, una riduzione dell’espressione del biomarker di disfunzione endoteliale (E-selectina) e promuove la produzione endogena di NO (Reshef et al., 2005; Rizza et al., 2011). In modelli sperimentali ex-vivo e in vivo di ischemia da riperfusione, è stato dimostrato che la Naringina esercita effetti cardioprotettivi promuovendo la riduzione dell’uptake di calcio mitocondriale, così come riduce la probabilità di formazione del poro di transizione della permeabilità mitocondriale e la morte apoptotica dei miocardiociti (Testai et al., 2013; Testai et al., 2013; Testai et al., 2015).
Per quanto riguarda i lipidi, è stato dimostrato il ruolo dei flavonoidi nella progressione dell’aterosclerosi. L’ipercolesterolemia, e in generale l’iperlipidemia, rappresentano un importante fattore di rischio per lo sviluppo dell’aterosclerosi e delle patologie a carico delle arterie coronarie (Baigent et al., 2005; Gielen et al., 2009). I parametri patogenetici in aumento a livello
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sanguigno sono: la concentrazione del colesterolo legato alle lipoproteine a bassa densità (LDL), il colesterolo totale e i trigliceridi. Condizioni di insulino-resistenza, tra cui una diversa tolleranza al glucosio e il “prediabete”, sono anch’esse un fattore di rischio cardiovascolare (Jones, 2008). La maggior parte dei protocolli terapeutici prevede l’utilizzo di farmaci appartenenti alla famiglia delle Statine. Esse inibiscono l’attività della 3-idrossi-3-metilglutaril-CoA
(HMG-CoA) reduttasi, la quale catalizza la via biosintetica del mevalonato, la chiave
intermedia del metabolismo del colesterolo. Questo è associato ad una diminuzione del colesterolo totale e ad un aumento delle lipoproteine ad alta densità (HDL) a discapito delle lipoproteine a bassa densità (LDL) (Baigent et al., 2005). Nonostante ciò, molti pazienti, soprattutto coloro che soffrono di sindrome metabolica, non riescono a raggiungere gli effetti desiderati dati dall’assunzione delle Statine (Jones, 2008). Inoltre, nel 40% dei pazienti affetti da queste patologie l’uso di tali farmaci è vietato. Ciò è dovuto alla possibile comparsa di effetti collaterali tra cui mialgia, miopatia e nel peggiore dei casi rabdomiolisi (Alsheikh-Ali, Karas, 2009; Joy, 2009). Ciò limita l’uso delle Statine e suggerisce il bisogno di un approccio terapeutico alternativo. È stato osservato che i flavonoidi possiedono una porzione 3-idrossi-3-metilglutarilica con similarità strutturale al substrato naturale dell’enzima HMG-CoA reduttasi, suggerendo che potrebbero essere responsabili dell’effetto ipocolesterolemizzante e potrebbero quindi rappresentare una valida terapia sostitutiva alle Statine (Di Donna et al., 2009).
Studi preclinici e clinici hanno dimostrato che la somministrazione di Naringina porta alla riduzione della placca aterosclerotica (Chanet et al., 2012), alla diminuzione del colesterolo legato alle LDL e dei trigliceridi e all’aumento del colesterolo legato alle HDL (Orhan et al., 2015).
Per quanto riguarda, invece, il glucosio, è stato osservato che i flavonoidi potrebbero inibire significativamente l’amilasi e la catalasi nella digestione dell’amido. Inoltre, la Naringina e la Neoesperedina (due tra i flavonoidi più
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attivi) andrebbero ad inibire la digestione dell’amilosio, mentre l’Esperidina e la Nobiletina inibiscono sia la digestione dell’amilosio che dell’amilopectina. I risultati dimostrano che i flavonoidi giocano un ruolo importante nel prevenire la progressione dell’iperglicemia, legandosi all’amido, aumentando la glicolisi epatica e la concentrazione del glicogeno e abbassando la gluconeogenesi epatica (Shen et al., 2012). L’Esperidina, la Naringina e la Nobiletina mostrano anche attività antidiabetica, in parte riducendo la gluconeogenesi epatica o aumentando la sensibilità all’insulina in animali diabetici (Akiyama et al., 2010).
Secondo uno studio condotto da Kurowska (2004), questi composti, analizzati singolarmente durante la sperimentazione animale, hanno mostrato una bassa attività nella riduzione del colesterolo totale, mentre gli estratti contenenti molti componenti a base di polifenoli sembrano avere una buona attività ipolipidemica sia nei modelli animali, sia negli studi sull’uomo. Da questo si deduce che ci potrebbe essere un sinergismo fra questi composti, che gioca un ruolo centrale nel produrre effetti benefici (Deveraj et al., 2004; Gorinstein et al., 2006; Kurowska, Manthey, 2004). Queste osservazioni spingono ad identificare le piante che presentano una migliore abilità nel prevenire l’iperlipidemia e le complicazioni cardiovascolari.
Tra i frutti del genere Citrus, il bergamotto è oggetto di particolare interesse poiché è considerato un promettente approccio nutraceutico al trattamento dell’ipercolesterolemia. Citrus bergamia somministrato ai ratti con iperlipidemia, ha mostrato una protezione a livello epatico, una significativa riduzione del colesterolo, dei trigliceridi e delle LDL ed un aumento dei livelli delle HDL. Questi effetti rappresentano la base per l’attività anti-aterogenica e sono responsabili della prevenzione delle patologie cardiovascolari (Cappello et al., 2016).
L’evidenza sperimentale ottenuta nel modello animale in cui vengono indotte l’ipercolesterolemia (Miceli et al., 2007; Trovato et al., 2010) e l’induzione di danno vascolare tramite stress meccanico (Mollace et al., 2008), supporta gli effetti ipolipidemici e vasoprotettivi dei costituenti del bergamotto. In ogni caso
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il potenziale terapeutico del bergamotto non è mai stato studiato sull’uomo, anche se l’uso tradizionale del bergamotto nella regione Calabria suggerisce da molto tempo il suo potenziale benefico nel contrastare l’aterosclerosi.
Lo studio portato avanti da Mollace et al. (2011) ha verificato, in un modello di ratto in cui è stata indotta iperlipidemia, l’effetto del bergamotto sul colesterolo totale, sulla concentrazione di LDL e HDL, sui trigliceridi e sul glucosio nel sangue. Per valutare le proprietà nutraceutiche dei flavonoidi del bergamotto, dal succo è stata ricavata una frazione in polvere, altamente ricca di polifenoli, mediante purificazione all’interno di una colonna contenente resina polistirenica. La polvere presenta all’interno circa il 26-28% di flavonoidi.
Lo studio sperimentale è stato strutturato in modo da avere quattro gruppi di 10 ratti ognuno. Il primo gruppo è stato trattato per 30 giorni consecutivi con una dieta ipercolesterolemica, in modo da avere un innalzamento dei livelli di colesterolo, LDL e trigliceridi. Il secondo e il terzo sono stati trattati con dieta ipercolesterolemica con l’aggiunta della polvere di bergamotto, rispettivamente 10 e 20 mg/Kg/die per 30 giorni. Ciò ha portato ad una significativa riduzione in colesterolo totale, concentrazione di LDL e trigliceridi e ad un moderato innalzamento della concentrazione delle HDL. Per contro non è stata notata una differenza nel peso corporeo tra i ratti trattati con la polvere di bergamotto e i ratti trattati con dieta iperlipidemica, usati come controllo. I risultati sono stati poi confrontati con il quarto gruppo costituito da ratti standard, usati come controllo, ma trattati con dieta normolipidemica.
17 Figura 6 Risultati dell’analisi sperimentale (Mollace et al., 2011)
In Figura 6 vengono riportati i risultati dell’analisi sperimentale dopo 30 giorni di trattamento, condotta da Mollace et al. (2011), dove è possibile mettere a confronto i diversi parametri in base al tipo di trattamento. Il simbolo “§”indica un valore significativamente diverso rispetto a quello ottenuto nel caso dei ratti trattati con dieta ipercolesterolemica [§ p<0.05]. Il simbolo “*” sta ad indicare un valore significativamente diverso da quello registrato nei ratti standard (CTRL) [* p<0.05]. Possiamo notare una riduzione significativa dei parametri di colesterolo totale, colesterolo LDL e trigliceridi per i ratti BPF, ovvero trattati con la frazione polifenolica di bergamotto, a entrambi i dosaggi, rispetto a hyperchol, che indica i ratti trattati con dieta ipercolesterolemica. Non si ha invece un’evidente variazione della concentrazione delle HDL, del peso corporeo (BW) e del glucosio nel sangue (BG).
Un altro studio è stato condotto da Mollace et al. (2011) su 237 pazienti che soffrivano di iperlipidemia associata o meno a iperglicemia. Ad essi veniva somministrata oralmente la polvere di bergamotto per 30 giorni (500-1000 mg/die). I risultati mostravano una significativa riduzione dei livelli del
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colesterolo totale, della concentrazione delle LDL, dei trigliceridi e del glucosio nel sangue. Per contro si aveva un aumento in concentrazione delle HDL.
Come spiegato dall’autore, alla base di questi risultati agisce un meccanismo in cui i composti presenti nella polvere potrebbero andare a modulare i livelli dell’enzima HMG-CoA reduttasi epatico. L’altro potenziale beneficio dato da questo trattamento è l’attività ipoglicemica. Sembrerebbe infatti che la Naringenina e altri polifenoli aumentino significativamente l’uptake di glucosio nelle cellule muscolari e del fegato (Hwang et al., 2009; Zygmunt et al., 2010).
L’attività ipoglicemica della Naringenina in vivo può essere molto complessa e potrebbe dipendere da vari effetti sul metabolismo dei lipidi, che conducono ad un aumento della sensibilità all’insulina e alla tolleranza al glucosio, come mostrato nei modelli animali con sindrome metabolica (Mulvihill et al., 2009).
- Attività antiossidante
I flavonoidi svolgono attività antiossidante con i seguenti meccanismi:
1. diretto assorbimento e neutralizzazione dei radicali liberi (Osawa, 1994), 2. inibizione degli enzimi associati con la via delle ROS: NADPH ossidasi,
xantina ossidasi e mieloperossidasi (Cotelle, 2001),
3. promozione dell’attività degli enzimi antiossidanti umani come superossido dismutasi, catalasi (Mari et al., 2010).
Per tale proprietà è stata vista una correlazione dose-dipendente (Kim et al., 2012).
- Attività antiinfiammatoria
La Naringina riduce l’infezione indotta da endotossine nei topi studiati e attenua l’infiammazione cronica polmonare neutrofilica nei ratti esposti a fumo di sigaretta (Nie et al., 2012). Il suo aglicone, la Naringenina, esercita attività antinfiammatoria sui macrofagi e sul sangue umano (Bodet et al., 2008). L’Esperidina esercita, nei topi in vivo, effetti sistemici antinfiammatori in casi di disturbi polmonari acuti, indotti da endotossine (Yeh et al., 2007). Per quanto
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riguarda la Nobiletina, è stata osservata la capacità di diminuire, in maniera dose – dipendente, i livelli di NO e di ridurre l’espressione dell’NO sintetasi (Harasstani et al., 2010). Un meccanismo simile è proprio della Quercetina, il cui scheletro è essenziale per la soppressione dell’NO sintetasi e dell’NO (Yoshigai et al., 2013).
- Attività anti-cancro
È stato osservato che il pre- e il post-trattamento con la Naringenina portano alla soppressione delle lesioni preneoplastiche associate a NDEA (N-nitrosodietilammina), sostanza conosciuta come cancerogena, andando a modulare la metabolizzazione degli xenobiotici da parte degli enzimi, alleviando la perossidazione lipidica e riducendo i livelli dei marker enzimatici epatici (Arul, Bramanian, 2013). La Tangeretina causa l’arresto della progressione del ciclo cellulare nella fase G1 e l’inibizione della crescita nelle cellule dell’adenocarcinoma del colon in incubazione (linea COLO 205) (Pan et al., 2002). La Quercetina presenta attività antiproliferative nei confronti del cancro del colon e della cervice, ma risulta inefficace nel cancro mammario (Steele et al., 1994). La Nobiletina esercita effetti inibitori nei confronti dell’adesione cellulare, dell’invasione e della migrazione delle cellule dell’adenocarcinoma gastrico (AGS) altamente metastatiche, a concentrazione non citotossica, attraverso la via Ras/PI3K/AKT (Lee et al., 2011).
- Attività neuroprotettiva
I flavanoni Esperidina, Esperetina e Neoesperidina, presentano attività neuroprotettive nei confronti della citotossicità indotta da H2O2, nella linea
cellulare del feocromocitoma (cellule PC12), tramite diversi meccanismi, tra cui l’attività antiossidante, la regolazione dei livelli di calcio intracellulare e l’inibizione dell’attività della caspasi-3 (Hwang, Yen, 2008). Uno studio clinico pilota sostiene che la somministrazione per un anno di decotto della buccia del frutto di Citrus reticolata, ricca di Nobiletina, possa portare beneficio nell’aumentare le capacità cognitive nei pazienti affetti da morbo di Alzheimer, senza comparsa di effetti avversi (Seki et al., 2013).
20 1.5 Proprietà farmacologiche dei limonoidi
- Attività antiiperglicemica e antiobesità
Il recettore degli acidi biliari, accoppiato a proteine G (TGR5,) è stato ipotizzato essere il target per farmaci attivi nel trattamento della sindrome metabolica, poiché la sua attivazione previene l’obesità e l’iperglicemia. In particolare è stato osservato che la Nomilina è un attivatore di TGR5 in topi trattati con una dieta ipercalorica, suggerendone l’impiego come agente anti-obesità e anti-iperglicemico (Ono et al., 2011). Nel voler chiarire il ruolo dell’Obacunone nella regolazione metabolica, tale composto è stato aggiunto come supplemento alla dieta in topi obesi ed è stato verificato che l’Obacunone stimola la trascrizione di TGR5 in maniera dose-dipendente. Inoltre, inibisce la differenziazione degli adipociti e antagonizza l’attività trascrizionale del recettore γ attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPARγ) ligando-stimolato (Horiba et al., 2015).
Il recettore TGR5, anche conosciuto come recettore 1 degli acidi biliari e accoppiato alle proteine G (GPBAR1), fa parte di una classe di recettori che comprende sette eliche transmembrana, tre cicli extracellulari e tre intracellulari. Il TGR5 riconosce gli acidi biliari come suoi ligandi endogeni (Maruyama et al., 2002; Kawamata et al., 2003) e il legame con il recettore attiva la subunità α delle proteine eterotrimeriche G, portando all’attivazione dell’adenilato ciclasi e ad un aumento intracellulare della concentrazione dell’AMP ciclico (c AMP). Di conseguenza, il cAMP promuove una proteina chinasi A (PKA)-cAMP, che regola diversi processi metabolici indipendentemente dal recettore farnesoide X, recettore nucleare degli acidi biliari (Maruyama et al., 2002; Kawamata et al., 2003; Taoka et al., 2016).
Il recettore TGR5 è espresso in differenti tessuti e organi, inclusi il tessuto adiposo bruno (BAT), l’intestino tenue e il muscolo scheletrico (Duboc et al., 2014). È stato dimostrato che il recettore TGR5 stimola il consumo di energia attraverso l’induzione nel tessuto adiposo bruno della iodotironina deiodinasi di
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tipo 2, un enzima CAMP dipendente attivante l’ormone tiroideo, previene
l’obesità indotta da dieta ricca di grassi e l’insulino-resistenza (Watanabe et al., 2006). Inoltre, l’attivazione del recettore TGR5 induce il rilascio del peptide-1 glucagone-simile (GLP-1) dalle cellule L enteroendocrine; in tal modo si ha la protezione nei confronti dell’insulino resistenza e un aumento della tolleranza al glucosio in topi obesi (Thomas et al., 2009; Harach et al., 2012; Briere et al., 2015; Cao et al., 2016). A causa di questi effetti benefici, il TGR5 è riconosciuto come un importante target nel trattamento della sindrome metabolica (van Nierop et al., 2016). Recentemente sono stati descritti agonisti di questo recettore sia sintetici che naturali; tra questi ultimi troviamo l’Acido oleanolico, l’Acido betulinico e l’Acido ursolico, trovati nelle piante (Genet et al., 2010; Sato et al., 2007). Anche la Nomilina, limonoide estratto dai frutti del genere Citrus, presenta un’attività agonista nei confronti del recettore TGR5 e la presenza nella dieta di questo composto contrasta l’obesità e l’iperglicemia nei topi con cui è stato condotto lo studio (Ono et al., 2011).
In uno studio condotto da Sasaki et al. (2017), è stato determinato quali sono i residui amminoacidici interessati nell’interazione con la Nomilina e sono state identificate le caratteristiche molecolari della stessa, necessarie per essere riconosciuta come agonista del recettore. È stato scoperto che il TGR5 umano mostra una più alta risposta rispetto a quello esistente nei topi, indipendentemente dalla loro omologia. Con queste considerazioni sono state sviluppate varie chimere murino-umane del recettore TGR5 per accertare le regioni critiche dell’interazione della nomilina. Sono state rivelati tre residui hTGR5 essenziali per questa interazione: Q77 (ECL1), R80 (ECL1) e Y89 (3.29).
L’Obacunone, un limonoide con struttura simile alla Nomilina, mostra un’attività semi-specifica nei confronti del recettore hTGR5 sui tre residui amminoacidici menzionati precedentemente. La Limonina, invece, non riesce ad attivare il recettore hTGR5 a causa della repulsione sterica fra l’anello lattonico a
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sei atomi e l’anello furanico. Infatti, la Limonina presenta una debole attività agonista nei confronti di questo recettore (Ono et al., 2011).
Il PPARγ è un membro dei fattori di trascrizione nucleari ligando attivati e si trova in elevate quantità all’interno del tessuto adiposo, dove gioca un ruolo nella differenziazione degli adipociti e nel mantenere le caratteristiche degli adipociti maturi (Rosen et al., 1999; Tamori et al., 2002). Il PPARγ è il target molecolare dei farmaci Tiazolidindioni, agenti antidiabetici che migliorano l’insulino-resistenza. È stato osservato che molti composti naturali tra cui anche i flavonoidi, potrebbero agire come ligandi di tale recettore (Liu et al., 2008; Horiba et al., 2010). Per quanto riguarda i limonoidi è stato osservato che presentano vari effetti benefici sulla salute, ma la loro attività sui disordini metabolici è sconosciuta.
In uno studio condotto da Horiba et al. (2015), vengono osservati gli effetti fisologici dell’Obacunone nelle varie caratteristiche della sindrome metabolica, quando viene somministrato a topi diabetici e obesi. Questi ultimi vengono confrontati con topi sottoposti ad una dieta di controllo (standard) o con topi con dieta integrata dello 0.1% di Obacunone per 28 giorni. I risultati di questo studio sono riportati nei diagrammi rappresentati in Figura 6.
23 Figura 7 Confronto tra topi trattati con dieta integrata con 0,1% di
Obacunone per 28 giorni e topi trattati con dieta di controllo (Horiba et al., 2015).
Il peso corporeo non è influenzato dall’integrazione del limonoide nella dieta (Figura 7A). Al contrario, lo stesso trattamento riduce l’accumulo della massa grassa viscerale e di quella subcutanea. Inoltre non c’è differenza tra la massa del tessuto adiposo bruno e quello bianco (Figura 7B). La massa dei muscoli quadricipite e gastrocnemio aumenta significativamente nei topi trattati con l’Obacunone (Figura 7C). Questi risultati indicano che tale composto integrato
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nella dieta potrebbe rappresentare una strategia da utilizzare nella prevenzione dell’iperglicemia e dell’obesità.
L’incretina GLP-1 è un peptide intestinale derivante da un precursore sintetizzato dalle cellule L enteroendocrine dell’epitelio intestinale (Holst, 2007). L’aumento della secrezione intestinale di tale sostanza, indotta dall’attivazione del TGR5, ha portato all’accrescimento della tolleranza al glucosio in topi obesi (Thomas et al., 2009). Anche se non statisticamente significativi, il livelli nel siero di GLP-1 nei topi trattati con Obacunone sono più alti rispetto a quelli dei controlli, come è possibile osservare in Figura 8.
Figura 8 Effetti ipoglicemici su topi trattati con obacunone 0.1% per 28 giorni,
confrontati con topi trattati con dieta di controllo. A) glucosio nel sangue ed emoglobina glicata misurati dopo 16h. B) GLP-1 e insulina raccolti in siero e misurati dopo 16h (Horiba et al., 2015).
Considerando che questo composto ha stimolato l’attività del recettore TGR5 in maniera dose-dipendente, è concepibile che l’Obacunone abbia esercitato gli
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effetti di abbassamento di glicemia andando a potenziare la via del TGR5-GLP-1. In generale, la secrezione di GLP-1 è indotta dopo l’ingestione di cibo e conseguentemente degradata dalla Dipeptidil peptidasi 4 (DPP-4). Perciò, i livelli di GLP-1 nei campioni di sangue utilizzati in questo studio potrebbero ritornare al livello della pre-secrezione basale. È possibile che la continua stimolazione dell’attività del TGR5, tramite il consumo giornaliero di Obacunone contenuto nella dieta, abbia contribuito all’incremento dei livelli di GLP-1.
Allo stesso modo è risultato interessante come il trattamento con tale composto non abbia solo migliorato il metabolismo del glucosio nel sangue, ma abbia anche aumentato relativamente la massa dei muscoli scheletrici (quadricipite e gastrocnemio) nei topi studiati. Un recente studio ha riportato il ruolo considerevole del TGR5-AKT-mTOR, considerato il principale mediatore del normale accrescimento del muscolo e dell’ipertrofia muscolare, così come il coordinatore dei processi relativi alla sintesi delle proteine (Bodine et al., 2001; Glass, 2003; Parkington et al., 2003; Leger et al., 2006).
Queste osservazioni indicano la possibilità dell’Obacunone di aumentare l’ipertrofia muscolare attraverso la modulazione del TGR5-AKT-mTOR nei muscoli scheletrici. Questi effetti sono probabilmente mediati dall’attivazione del segnale del cAMP nel muscolo scheletrico, così come l’inibizione della fosfodiesterasi riduce l’atrofia (Hinkle et al., 2005; Baviera et al., 2007).
L’Obacunone da un lato stimola l’attività trascrizionale del TGR5, dall’altro antagonizza la transattivazione ligando-dipendente del recettore PPARγ. I Tiazolidindioni sono una classe di composti che si comportano da ligandi del recettore PPARγ, andando ad incrementare la sensibilità all’insulina che abbassa i livelli di glucosio nel sangue; tuttavia i loro effetti benefici sono oscurati dal rischio di avere un aumento del peso corporeo dovuto all’aumento della massa grassa (Burkey et al., 2000; Wang et al., 1997; Kelly et al., 1999). D’altra parte molti studi hanno dimostrato che la parziale inibizione dell’attività trascrizionale di PPARγ potrebbe contribuire alla prevenzione dello sviluppo
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dell’insulinoresistenza e dell’obesità. È stato riportato che topi eterozigoti PPARγ-deficienti sono protetti dalla progressione dell’insulino resistenza e dall’ipertrofia degli adipociti, quando sono sottoposti a una dieta ipercalorica (Kubota et al., 1999). Altri studi hanno riportato che gli antagonisti del recettore PPARγ inibiscono la differenziazione degli adipociti e l’adipogenesi (Wright et al., 2000; Camp et al., 2001).
Tenendo conto del fatto che l’Obacunone ha effetti inibitori sull’accumulo di lipidi negli adipociti in differenzazione, gli effetti osservati nel tessuto adiposo bruno nei topi trattati con Obacunone potrebbero essere dovuti alla moderata inibizione del recettore PPARγ da parte di tale composto. Questa inibizione, così come l’attivazione del TGR5, potrebbe contribuire all’effetto ipoglicemico dell’Obacunone e all’inibizione dell’accumulo di lipidi nel tessuto adiposo bruno (Horiba et al., 2015).
- Attività analgesica e antinfiammatoria
Kim et al. (2011) hanno studiato il coinvolgimento dei limonoidi nei processi infiammatori tramite la modulazione dell’attività della MAP chinasi p38 nelle cellule del muscolo liscio. Tra i limonoidi è stato osservato che la Nomilina manifesta la più alta attività inibitoria sulla MAP chinasi, seguita dalla Limonina, dalla Deacetilnomilina e dalla Defurannomilina. Inoltre, l’attività del TNF-α (Tumor Necrosis Factor) indotta dalla MAP kinasi p38 nei muscoli lisci, risulta completamente inibita dalla Nomilina. La Limonina promuove l’attenuazione dei marker di danno epatico, dell’infiammazione epatica, di stress ossidativo e dell’espressione del TLR-4 in un modello di ratto con infiammazione epatica acuta (Mahmoud et al., 2014). Il meccanismo di questi effetti epatoprotettivi è collegato al potenziale antiossidante e antinfiammatorio della Limonina (Mahmoud et al., 2014). Un altro studio condotto da Kelly et al. (2015) ha esaminato gli effetti della Limonina glucoside sulla circolazione dei biomarker di infiammazione cronica dovuti a steatosi epatica non alcolica, diabete e cancro in
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individui in sovrappeso o obesi. Il risultato è stato un decremento dei livelli degli enzimi epatici circolanti come la γ-glutamil-transferasi, l’alanina amino transferasi e la fosfatasi alcalina. La Limonina glucoside inoltre riduce significativamente i livelli nel sangue dei marker pro-infiammatori, in particolare del componente C3 del complemento e del TNF-α.
- Attività anticancro e antiossidante
Considerando che l’overespressione degli isoenzimi del Citocromo P450 (CYP1A2, CYP1B1, CYP19 e CYPEA4) è implicata nella comparsa del tumore del polmone, del colon e della prostata, Poulose et al. (2007) hanno valutato gli effetti dei limonoidi in forma agliconica e glucosidata nell’attività degli isoenzimi umani del CYP. È stata osservata un’inibizione di questi, in maniera dose dipendente. Analisi cinetiche indicano che la Limonina glucoside inibisce il CYP19 competitivamente, mentre il glucoside dell’Acido Nomilinico inibisce lo stesso isoenzima tramite un legame non competitivo. La differenza in questa inibizione può essere dovuta alle variazioni strutturali del nucleo dei limonoidi. La Limonina ha anche un ruolo nell’epatoma (Langeswarana et al.,2013), nel meningioma (Shimizu et al., 2015) e, come la Deacetilnomilina, presenta citotossicità nei confronti delle cellule leucemiche (CEM/ADR5000), andando a svolgere un’inibizione della P-glicoproteina (PGP). L’Obacunone e il suo glucoside inibiscono la proliferazione cellulare del cancro del colon, andando ad attivare il citocromo c che porta come conseguenza all’induzione dell’apoptosi intrinseca. Gli effetti citotossici dell’Obacunone sono stati testati anche nelle cellule del cancro del seno (Kim et al., 2014), in cui è stata osservata un’attività inibitoria sulla proliferazione.
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- Attività antivirale e antibatterica
Balestrieri et al. (2011) hanno studiato gli effetti dell’estratto di C. bergamia e di due limonoidi da esso isolati, la Limonina e la Nomilina, sul virus HTLV-1. I loro risultati mostrano l’efficacia di queste sostanze nell’inibire il virus HTLV-1 così come l’espressione del virus HIV-1 nelle cellule infette, attività molto vicina a quella studiata su composti standard. In un altro studio l’Acido limonexico ha mostrato di inibire l’espressione dell’antigene superficiale dell’epatite B (Zhao et al., 2012).
Vikram et al. (2012) hanno studiato e dimostrato gli effetti dell’Obacunone nell’inibire la Salmonella enterica andando a reprimere l’isola patogenica 1 (SPI1), il trasporto del maltosio e l’operone idrogenasi. Sempre lo stesso gruppo ha studiato la capacità dell’Obacunone, dell’Acido glucosidico deacetilnomilinico e dell’Acido isolimonico di inibire il segnale cellula-cellula e la formazione del biofilm nel Vibrio harveyi, un batterio marino bioluminescente.
- Attività insetticida e larvicida
L’attività larvicida dei composti derivati dai frutti del genere Citrus è stata valutata contro l’Aedes albopictus, la cosiddetta “zanzara tigre” (Bilal et al., 2012), mentre Yu et al. (2015) hanno valutato l’attività insetticida di una serie di esteri strutturalmente collegati all’Obacunone nei confronti del terzo stadio larvale della Mythimna separata Walker, un tipico lepidottero parassita.
- Attività inibitoria dell’osteoclastogenesi
La Nomilina è stata studiata in vitro per un potenziale uso nell’inibizione dell’osteoclastogenesi. È stato osservato che tale composto diminuisce significativamente il numero delle cellule multinucleate TRAP-positive (una misurazione del numero degli osteoclasti) quando messo a confronto con il
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controllo. Inoltre, concentrazioni non tossiche del composto riducono l’attività di riassorbimento e portano ad una down regulation dei geni specifici degli osteoclasti. Questo studio suggerisce il potenziale terapeutico della Nomilina nella prevenzione dell’osteoporosi (Kimira et al., 2015).
1.6 Scopo della ricerca
Le patologie cardiovascolari, incluse infarto del miocardio, dislipidemie e patologie a carico delle arterie coronarie, sono una delle più comuni cause di morte nei Paesi occidentali. Evidenze epidemiologiche e studi preclinici e clinici dimostrano che i flavonoidi del genere Citrus presentano effetti positivi sui parametri cardiometabolici. In particolare, in studi preclinici, è stata osservata la capacità della Naringenina, uno dei principali flavonoidi presenti nel genere
Citrus, di ridurre i livelli di colesterolo totale e di trigliceridi e di indurre
l’incremento del colesterolo legato alle HDL a discapito del colesterolo legato alle LDL. In altri studi è stata osservata l’azione antiipertensiva di flavonoidi come la Naringenina e l’Esperetina nell’indurre vasodilatazione attraverso la produzione endoteliale di NO. Inoltre, nelle arterie coronarie isolate di roditori, l’Esperetina causa vasodilatazione tramite l’attivazione dei canali al calcio voltaggio-dipendenti e della corrente al potassio (Liu et al., 2014). In studi clinici è stata indicata una chiara correlazione tra il consumo di flavonoidi del genere Citrus, la vasodilatazione e la riduzione della disfunzione endoteliale, tramite una riduzione significativa del biomarker di disfunzione endoteliale (E-selectina) e l’aumento della produzione endogena di NO.
In studi preclinici sono stati riportati i benefici cardiovascolari di un’altra classe di composti tipica del genere Citrus, nota con il nome di limonoidi. Questi hanno dimostrato effetti benefici nell’obesità e nell’iperglicemia. Infatti, è stata osservata l’interazione di questi composti, in particolare dell’Obacunone, con i recettori TGR5 e PPARγ, tale da promuovere una maggiore tolleranza al glucosio e una riduzione della massa grassa viscerale e subcutanea in topi diabetici e
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obesi. L’Obacunone inoltre ha effetti inibitori sull’accumulo di lipidi negli adipociti in differenziazione, attività che potrebbe essere dovuta all’inattivazione del recettore PPARγ.
In tale contesto, lo scopo di questa tesi di Laurea è stato quello di studiare i potenziali effetti benefici sul sistema cardiovascolare posseduti da Citrus x
bergamia Risso (famiglia Rutaceae), un frutto autoctono comunemente chiamato
bergamotto e contenente abbondanti quantità di flavonoidi. A questo scopo, il bergamotto è stato sottoposto a spremitura manuale per ottenere il succo, che è stato oggetto dello studio. Una prima parte della tesi è stata dedicata alla valutazione analitica dei costituenti chimici presenti nel succo e potenzialmente responsabili degli effetti farmacologici. Quindi è stato effettuato uno studio pre-clinico in cronico su ratti trattati con una dieta ad alto contenuto di grassi, in modo da sviluppare dopo 21 giorni un quadro sintomatologico riconducibile alla sindrome metabolica nell’uomo. Un gruppo di questi ratti è stato trattato contemporaneamente con il succo di bergamotto diluito al 6% v/v, attraverso l’acqua da bere e successivamente un altro gruppo è stato trattato con succo di bergamotto al 12% v/v sempre con la stessa modalità di somministrazione. Parametri antropometrici e cardiometabolici sono stati valutati al termine del trattamento, in modo da valutare insieme ad altri marker predittivi della funzionalità mitocondriale e dei processi infiammatori, il potenziale nutraceutico di Citrus bergamia e il suo possibile impiego futuro nel trattamento/prevenzione della sindrome metabolica.
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CAPITOLO 2
Materiali e metodi
2.1 Preparazione del campione
Per l’analisi con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), accoppiata a un rivelatore photodiode array/ultravioletto/ (PDA-UV) e a uno spettrometro di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS), il succo (1.5 mL) è stato aggiunto alla dimetilformammide (DMF; 1.5 mL) e la miscela è stata centrifugata per tre volte per 5 min a 3200 rpm. Il liquido supernatante è stato filtrato attraverso una membrana di 3 mm di diametro, costituita da politetrafluoroetilene (PTFE) con pori di 0.45 µm di diametro. Aliquote di 20 µL sono state iniettate nel sistema LC-MS.
2.2 Analisi HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS
L’analisi qualitativa HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS è stata eseguita utilizzando una pompa Surveyor LC, un autocampionatore Surveyor, accoppiato con un rivelatore Surveyor PDA e con lo spettrometro di massa a trappola ionica LCQ (ThermoFinnigan) equipaggiato con il programma Xcalibur 3.1. L’analisi è stata eseguita utilizzando una colonna Synergi Fusion-RP (Phenomenex) di dimensioni 4.6 x 150 mm, 4 µm. Come eluente è stata utilizzata una miscela costituita da acetonitrile (solvente A) e acqua (solvente B), secondo il seguente gradiente: 0-15 min 5-20% A, 0-15-40 min 20-70% A, 40-45 min 70-100% A. L’eluizione è stata eseguita a un flusso di 0.8 mL/min utilizzando un sistema di splittaggio di 2:8, rispettivamente per il rivelatore MS (160 µL/min) e il rivelatore PDA (640 µL/min). Il volume del campione iniettato (soluzione del succo e della DMF) corrisponde a 20 µL. L’analisi è stata effettuata utilizzando un’interfaccia ESI in modalità negativa. Le condizioni di ionizzazione sono state ottimizzate e sono stati utilizzati i seguenti parametri:
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- temperatura del capillare, 210°C; - voltaggio del capillare, -10.0V; - gas, 60.00 unità arbitrarie;
- flusso del gas ausiliario, 20.00 unità arbitrarie; - voltaggio dello spray, 4.50 kV;
- intervallo di scansione, m/z 150-1200.
L’azoto molecolare è stato utilizzato sia come sheath gas sia come gas ausiliario. I dati del PDA sono stati registrati in un intervallo di lunghezza d’onda compreso tra 200 e 600 nm, utilizzando due canali preferenziali alle lunghezze d’onda di 280 e 325 nm.
2.3 Sperimentazione animale
Gli esperimenti sono stati condotti su ratti albini del ceppo Wistar di sesso maschile. Ogni animale è stato stabulato singolarmente in condizioni controllate con cicli di luce/buio di 12 ore, una temperatura di 22 ± 1°C e cibo ed acqua ad libitum. Tutti gli animali sono stati pesati giornalmente per accertarsi che il peso raggiungesse un minimo di 300 g, tale da poter iniziare il trattamento.
La sperimentazione è stata condotta in conformità alla normativa comunitaria (direttiva CEE 750/2013) e alla normativa italiana (DL n° 26/2014).
2.4 Primo trattamento
Gli animali sono stati divisi in tre gruppi e trattati per 21 giorni; in particolare: il primo gruppo (STD) è stato alimentato somministrando 100g/die di pellet
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standard (per la composizione vedi Figura 10), il secondo gruppo (HFc) è stato alimentato con 100g/die di pellet ad alto contenuto lipidico arricchito con colesterolo +1,25% p/p (per la composizione vedi figura 9), il terzo gruppo (HFc + CB 6%) è stato alimentato con 100g/die di pellet ad alto contenuto lipidico arricchito di colesterolo +1,25% p/p, in più è stato somministrato oralmente (nell’acqua da bere) un estratto di Citrus Bergamia (CB) in forma di succo, ottenuto dalla spremitura di tre differenti cultivars (“Fantastico”, “Femminello” e “Castagnaro”), ad una concentrazione corrispondente al 6% v/v.
Una volta ogni due giorni è stato monitorato il peso dei singoli animali e giornalmente l’intake di cibo e acqua, al fine di valutare il loro benessere. Come da protocollo, al ventunesimo giorno di trattamento i ratti sono stati sacrificati.
2.5 Secondo trattamento
Gli animali sono stati divisi in tre gruppi e trattati per 21 giorni; il primo gruppo (STD) è stato alimentato somministrando 100g/die di pellet standard, il secondo gruppo (HFc) è stato alimentato con 100g/die di pellet ad alto contenuto lipidico arricchito di colesterolo +1,25% p/p, il terzo gruppo (HFc + CB 12%) è stato alimentato con 100g/die di pellet ad alto contenuto lipidico arricchito di colesterolo 1,25% p/p e con un estratto di Citrus Bergamia in forma di succo, ottenuto dalla spremitura di tre differenti cultivar (“Fantastico”, “Femminello” e “Castagnaro”), somministrato oralmente (nell’acqua da bere) in modo che la concentrazione corrisponda al 12% v/v. Una volta ogni due giorni è stato monitorato il peso dei singoli animali e giornalmente l’intake di cibo e acqua, al fine di valutare il loro benessere. Come da protocollo, al ventunesimo giorno sono stati sacrificati.
34 2.6 Protocollo sperimentale
Tutti i ratti sono stati sacrificati al termine del trattamento con un’overdose di tiopentale sodico (MSD Animal health). Prima dell’anestesia, ad ogni ratto è stata misurata la glicemia a digiuno (24h) dalla vena caudale (Glucocard G meter, Menarini Diagnostics®). Una volta anestetizzati sono stati sottoposti a sternotomia per poi eseguire un prelievo di sangue intracardiaco e immediatamente trasferirlo in provette con EDTA come anticoagulante (BD Vacutainer®). Il sangue intero è stato subito utilizzato per misurare la glicemia intracardiaca (Glucocard G meter, Menarini Diagnostics®), il panel lipidico e i livelli di emoglobina glicata con lo strumento Cobas b101 (Roche Diagnostics®). Successivamente sono stati prelevati il cuore, il fegato e il tessuto adiposo addominale ed epididimale. Il fegato, una volta toelettato e lavato in PBS 1X (pH 7.4), è stato asciugato con carta assorbente, pesato e fotografato. Una porzione di fegato (in particolare il lobo centrale) è stato fissato in paraformaldeide al 4%, per effettuare in un secondo momento l’esame istologico. Il cuore è stato pesato e toelettato, successivamente una piccola porzione è stata tagliata e conservata a -80°C per essere destinata al test ELISA (paragrafo 2.10). La porzione cardiaca restante è stata posta in STE (pH 7.4). per poi subire il protocollo di isolamento dei mitocondri ( come descritto nel paragrafo 2.7). Il tessuto adiposo addominale ed epididimale viene pesato e poi scartato senza subire ulteriori processi.
2.7 Protocollo di isolamento dei mitocondri cardiaci
Come visto precedentemente nel protocollo 2.4, in seguito al sacrificio tramite anestesia, il cuore è stato espiantato e immediatamente posto in un buffer di isolamento denominato STE, mantenuto costantemente in ghiaccio (4°C). Successivamente viene sminuzzato e lavato dal sangue residuo con STE, utilizzando forbici chirurgiche in modo da ottenere pezzetti dello spessore di circa 2 mm3. I lavaggi vengono effettuati più volte in modo da allontanare il più
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possibile il sangue residuo. Una volta completato lo sminuzzamento, i pezzetti di tessuto cardiaco vengono trasferiti in un tubo da centrifuga e sospesi in 20 ml di STE; il tutto viene poi omogeneizzato per mezzo di un omogeneizzatore Ultra-Turrax (modello: IKA, T-18 Basic). Vengono effettuati in ghiaccio tre cicli di omogeneizzazione da 20 secondi l’uno e in seguito la sospensione viene centrifugata a 1075 giri per 3 min a 4°C. Al termine della centrifugazione, il surnatante viene trasferito in un nuovo tubo da centrifuga e messo in ghiaccio, mentre il pellet viene scartato. Il surnatante viene centrifugato a 11950 giri per 10 min a 4°C. Si scarta il surnatante e a questo punto vengono aggiunti al pellet pochi ml di STE, tramite una bacchetta di vetro fredda si sospende, si trasferisce in un potter in cui il volume viene riportato a 10 ml e si omogenizza il tutto con il pestello. La sospensione viene trasferita nuovamente in un tubo da centrifuga e si effettua la centrifugazione a 11950 giri per 10 min a 4°C. Al termine della stessa, si elimina il surnatante e si effettua una procedura analoga alla precedente all’interno del potter, ma questa volta, utilizzando un buffer di isolamento denominato ST. Viene effettuata un’ultima centrifuga a 11950 giri per 10 min a 4°C, al termine della quale si scarta il surnatante, si aggiungono 300-400 µl di ST, si omogenizza nel potter con il pestello e infine si trasferisce il tutto in una eppendorf che verrà conservata in ghiaccio per tutta la durata dell’esperimento, per un tempo massimo di due ore.
La concentrazione di proteine mitocondriali viene determinata utilizzando la reazione di Bradford: tale metodo è basato sul legame del colorante Comassie Brillant Blue ai gruppi sulfidrilici delle proteine mediante misurazione del picco massimo di assorbanza a 595 nm, utilizzando uno spettrofotometro (Enspire, Perkin Elmer). Per costruire la retta di taratura è necessario effetturare varie diluizioni della sospensione mitocondriale ottenuta, prelevandone un volume di 50 µl. In questo modo si ottengono, tramite il saggio di Bradford, tanti picchi di assorbanza quante sono le diluizioni effettuate. Questi risultati vengono confrontati con quelli ottenuti utilizzando albumina sierica bovina standard (BSA), anch’essa sottoposta a diluizioni e saggio di Bradford. Per costruirne la
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retta di taratura viene utilizzato il programma GraphPad Prism 6.0 e successivamente si osserva se i punti di assorbanza, appartenenti alla soluzione mitocondriale, sono compresi tra quelli appartenenti alla retta del BSA. In questo modo viene accertata la validità del lavoro compiuto e può essere ricavata la concentrazione di proteine mitocondriali presente nella sospensione contenuta nella eppendorf.
2.7.1 Valutazione delle variazioni del potenziale di membrana mitocondriale
Il potenziale di membrana (Δ𝜑𝑚) dei mitocondri isolati viene determinato
utilizzando dei cationi liposolubili. La liposolubilità è importante poiché solo in questo modo gli ioni possono attraversare liberamente le membrane biologiche e distribuirsi tra la matrice e il mezzo di isolamento extramitocondriale. La concentrazione nel mezzo può essere determinata con un elettrodo selettivo per uno specifico ione in maniera potenziometrica, in questo modo possiamo controllare l’accumulo dello ione e valutare il potenziale di membrana. Il catione lipofilo utilizzato è il TPP+ (tetrafenilfosfonio); i cambiamenti di concentrazione
del TTP+ nel mezzo di sospensione costituito da Swelling buffer addizionato di
EGTA 1mM, vengono misurati con un mini-elettrodo sensibile al TPP+ (WPI
TipTPP), accoppiato ad un elettrodo di riferimento (WPI, FL, US), utilizzando un software di acquisizione dei dati (Biopac Inc. California, USA). Gli elettrodi vengono calibrati prima di ogni esperimento utilizzando concentrazioni note di TPP+Cl- (Sigma-Aldrich). Il buffer di sospensione viene messo all’interno di un
piccolo becker, nel quale vengono immersi i due elettrodi sopra citati, viene aggiunta una concentrazione nota di TPP+ (10 µM) e successivamente i
mitocondri (in concentrazione 1mg/ml), mantenendo la soluzione in continua agitazione magnetica. Si attende che il catione venga accumulato nei mitocondri per avere una stima del potenziale di membrana mitocondriale basale.
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Il valore del potenziale di membrana è calcolato secondo la seguente equazione sperimentale derivata da quella di Nerst:
∆𝜑𝑚 = 60 x log
𝑉0 [𝑇𝑃𝑃+]0
[𝑇𝑃𝑃+]𝑡 − 𝑉𝑡− 𝐾0𝑃
𝑉𝑚𝑃+ 𝐾𝑖𝑃
Dove Δ𝜑𝑚 è il potenziale di membrana mitocondriale (mV), V0 è il volume del
mezzo di incubazione prima dell’aggiunta dei mitocondri, Vt è il volume del
mezzo di incubazione dopo l’aggiunta dei mitocondri, Vm è il volume della
matrice mitocondriale (µl/mg proteina), [TPP+]
0 e [TPP+]t rappresentano,
rispettivamente, le concentrazioni di TPP+ registrati prima dell’aggiunta e al
tempo t, P è la concentrazione delle proteine espressa in mg, K0 e Ki sono i
coefficienti di partizione, interni ed esterni, del TPP+, stimati, rispettivamente,
attorno a 14,3 µl/mg e 7,9 µl/mg. Il potenziale di membrana basale è stato registrato nei mitocondri isolati da cuori di ratti STD, HFc, HFc + CB 6% e HFc + CB 12%. I risultati sono stati analizzati mediante metodi computerizzati (Software: GraphPadPrism 6.0).
2.8 Analisi dei dati
I dati ottenuti sono stati elaborati col programma GraphPad Prism 6.0, in particolare per l’analisi statistica è stato utilizzato il metodo di analisi t student allo scopo di valutare la differenza statistica tra i valori ottenuti nel controllo alimentato con dieta STD e i valori ottenuti nei gruppi alimentati con le diverse diete iperlipidiche.
38 2.9 Tecnica di colorazione con Oil Red O
Il colorante lipofilo Oil Red O (ORO) è ampiamente utilizzato per caratterizzare le cellule adipose differenziate, perché è in grado di legare i lipidi neutri contenuti nelle vescicole grasse delle cellule mature, evidenziandole in rosso. In questo lavoro la colorazione ORO è stata contrastata con Ematossilina che colora in blu il citoplasma e, più intensamente, il nucleo. I campioni cellulari sono stati fissati in paraformaldeide 4% e congelati, quindi sono state tagliate fettine di 8-10 mm. Dopo la reidratazione di 8-10 min in acqua, il campione è stato incubato per 15 min con la soluzione di colorante, preparata prima di ogni saggio e formata da due parti di acqua distillata e tre parti di soluzione madre di ORO (5mg/ml di ORO in isopropanolo). Allontanato il colorante in eccesso, il campione è stato lavato con isopropanolo 60%, e incubato con ematossilina per alcuni minuti a temperatura ambiente; dopo i lavaggi in acqua e una veloce asciugatura in stufa, il campione è stato montato su vetrino copri oggetto con montante acquoso.
2.10 Analisi delle citochine
L’analisi dell’ Interleuchina-6 (IL-6) e del fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) è stata eseguita sul tessuto cardiaco con metodo ELISA, in collaborazione con i laboratori dell’Università di Firenze, eseguiti dal Dott. Di Cesare Mannelli.
2.11 Soluzioni
PBS 1X = Soluzione salina preparata per diluizione di PBS 10X, la cui composizione è :
39
- NaH2PO4 X H2O 18.6 mM
- Na2HPO4 X H2O74.6 mM
- NaCl 1.5 M
PARAFORMALDEIDE 4% = Preparata per diluizione con PBS 1X di paraformaldeide 32%.
STE = Buffer di isolamento costituito da: - Saccarosio 250mM
- Tris 5mM - EGTA 1mM
ST = Buffer di isolamento costituito da: - Saccarosio 250 mM
- Tris 5 mM
SWELLING = Buffer di sospensione costituito da: - KCl 120mM
- K2HPO4 5 mM
- Hepes 10 mM - Succinato 10 mM - MgCl2 2 mM
40 Figura 9 Composizione dieta HFc
41 Figura 10 Composizione dieta STD
2014
Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet
Product Description- 2014 is a fixed formula, non-autoclavable diet
manufactured with high quality ingredients and designed to promote longevity and normal body weight in rodents. 2014 does not contain alfalfa or soybean meal, thus minimizing the occurrence of natural phytoestrogens. Typical isoflavone concentrations (daidzein + genistein aglycone equivalents) range from non-detectable to 20 mg/kg. Exclusion of alfalfa reduces chlorophyll, improving optical imaging clarity. Absence of animal protein and fish meal minimizes the presence of nitrosamines. Also available certified (2014C) and irradiated (2914). For autoclavable diet, refer to 2014S (Sterilizable).
Ingredients (in descending order of inclusion) - Wheat middlings, ground wheat, ground corn, corn gluten meal, calcium carbonate, soybean oil, dicalcium phosphate, iodized salt, L-lysine, vitamin E acetate, DL-methionine, magnesium oxide, choline chloride, manganous oxide, ferrous sulfate, menadione sodium bisulfite complex (source of vitamin K activity), zinc oxide, copper sulfate, niacin, calcium pantothenate, calcium iodate, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, thiamin mononitrate, vitamin A acetate, vitamin B12
supplement, folic acid, cobalt carbonate, biotin, vitamin D3 supplement.
Macronutrients
Crude Protein % 14.3
Fat (ether extract) a % 4.0
Carbohydrate (available) b % 48.0
Crude Fiber % 4.1
Neutral Detergent Fiber c % 18.0
Ash % 4.7
Energy Density d kcal/g (kJ/g) 2.9 (12.1)
Calories from Protein % 20
Calories from Fat % 13
Calories from Carbohydrate % 67
Minerals Calcium % 0.7 Phosphorus % 0.6 Non-Phytate Phosphorus % 0.3 Sodium % 0.1 Potassium % 0.6 Chloride % 0.3 Magnesium % 0.2 Zinc mg/kg 70 Manganese mg/kg 100 Copper mg/kg 15 Iodine mg/kg 6 Iron mg/kg 175 Selenium mg/kg 0.23 Amino Acids Aspartic Acid % 0.9 Glutamic Acid % 2.9 Alanine % 0.9 Glycine % 0.7 Threonine % 0.5 Proline % 1.2 Serine % 0.7 Leucine % 1.4 Isoleucine % 0.6 Valine % 0.7 Phenylalanine % 0.7 Tyrosine % 0.4 Methionine % 0.3 Cystine % 0.3 Lysine % 0.7 Histidine % 0.4 Arginine % 0.8 Tryptophan % 0.2
Teklad Diets are designed and manufactured for research purposes only.
© 2015 Envigo
Standard Product Form: Pellet
Vitamins Vitamin A e, f IU/g 6.0 Vitamin D3e, g IU/g 0.6 Vitamin E IU/kg 120 Vitamin K3 (menadione) mg/kg 20 Vitamin B1 (thiamin) mg/kg 12 Vitamin B2 (riboflavin) mg/kg 6
Niacin (nicotinic acid) mg/kg 54
Vitamin B6 (pyridoxine) mg/kg 10 Pantothenic Acid mg/kg 17 Vitamin B12 (cyanocobalamin) mg/kg 0.03 Biotin mg/kg 0.26 Folate mg/kg 2 Choline mg/kg 1030 Fatty Acids C16:0 Palmitic % 0.5 C18:0 Stearic % 0.1 C18:1ω9 Oleic % 0.7 C18:2ω6 Linoleic % 2.0 C18:3ω3 Linolenic % 0.1 Total Saturated % 0.6 Total Monounsaturated % 0.7 Total Polyunsaturated % 2.1 Other Cholesterol mg/kg -- a
Ether extract is used to measure fat in pelleted diets, while an acid hydrolysis method is required to recover fat in extruded diets. Compared to ether extract, the fat value for acid hydrolysis will be approximately 1% point higher.
bCarbohydrate (available) is calculated by subtracting neutral detergent
fiber from total carbohydrates. c
Neutral detergent fiber is an estimate of insoluble fiber, including cellulose, hemicellulose, and lignin. Crude fiber methodology underestimates total fiber. d
Energy density is a calculated estimate of metabolizable energy based on the Atwater factors assigning 4 kcal/g to protein, 9 kcal/g to fat, and 4 kcal/g to available carbohydrate.
e
Indicates added amount but does not account for contribution from other ingredients.
f
1 IU vitamin A = 0.3 µg retinol
g
1 IU vitamin D = 25 ng cholecalciferol
For nutrients not listed, insufficient data is available to quantify.
Nutrient data represent the best information available, calculated from published values and direct analytical testing of raw materials and finished product. Nutrient values may vary due to the natural variations in the ingredients, analysis, and effects of processing.
0915
42
CAPITOLO 3
Risultati e discussione
3.1 Parte fitoterapica
3.1.1 Analisi HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS
Il campione è stato sottoposto ad analisi HPLC-PDA/UV-ESI-MS/MS con la quale è stato possibile identificare i costituenti chimici presenti nel succo di C.
bergamia (Tabella 1). Tutti i composti sono stati identificati confrontando i dati
UV e ESI-MS con quelli presenti in letteratura (Gattuso et al., 2007; Sommella et al., 2013; Ledesma-Escobar et al., 2015; Russo et al., 2016 ). Nella Figura 11 è rappresentato il cromatogramma HPLC-PDA del succo ottenuto dalla miscela delle tre cultivar, mentre i dati cromatografici e spettrometrici sono riportati in Tabella 1.
Figura 11 Profilo HPLC-PDA, registrato a 280 nm, del succo di C. bergamia
(cultivars 'Fantastico' + 'Femminello' + 'Castagnaro'). I dati relativi ai picchi sono mostrati nella Tabella 1.
