IDROGEL A BASE DI LIPOHYAL

5.1 idrogeli e processo di reticolazione mediante radiazioni UV

Gli idrogeli sono dei particolari tipi di gel i quali possono essere definiti come sistemi dispersi solido/liquido in cui la fase liquida è immobilizzata in una struttura solida tridimensionale che va a costituire lo scheletro del gel. Nello specifico gli idrogeli o geli idrofili sono preparazioni le cui basi solitamente contengono acqua, glicerolo o glicole propilenico e possono essere classificati come naturali o sintetici: tra i polimeri sintetici, il più importante è l’HPMC, largamente utilizzato per la preparazione di compresse a rilascio controllato; tra quelli naturali, vi sono la gomma guar e la carragenina. La reticolazione del gel può essere determinata da sostanze gelificanti come poloxameri, amido, derivati della cellulosa, polimeri carbossivinilici e silicati di Magnesio- Alluminio, oppure può avvenire in presenza di stimoli fisici come pH, forza ionica, temperatura e radiazioni UV. Gli idrogeli manifestano un’elevata capacità di rigonfiarsi e di trattenere nella loro struttura significative frazioni di acqua (fenomeno di swelling), ma allo stesso tempo risultano incapaci di dissolversi in essa. La capacità di questi sistemi di assorbire acqua è dovuta ai gruppi funzionali idrofili legati allo scheletro polimerico, mentre l’insolubilità deriva principalmente dai legami crociati tra le catene della maglia polimerica e dalla presenza di impedimenti fisici come incatenamenti (Ahmed EM, 2013). Eliminando l’acqua dai geli idrofili si ottiene un residuo solido, denominato “xerogel” che rigonfiato in acqua origina nuovamente il gel ( F. Bettiol, Giugno 2010 ).

La formazione dell’idrogel a base di Lipohyal® avviene in presenza di stimoli fisici: le soluzioni acquose di Lipohyal® possono essere infatti facilmente reticolate mediante loro esposizione a radiazioni UV. Per quanto riguarda il meccanismo di reticolazione, l’LA subisce un’apertura reversibile dell’anello a livello del ponte disolfuro a causa

della radiazione UV e i gruppi tiolici ottenuti reagiscono a formare polimeri grazie alla formazione di nuovi ponti disolfuro. Se la reazione di legame coinvolge gruppi tiolici di LA appartenenti a diverse catene di acido ialuronico si assiste alla formazione di una rete tridimensionale e quindi dell’idrogel (Biewenga, Haenen, e Bast, 1997). Per dimostrare l’esistenza di un ponte disolfuro, un eccesso di ditiotreitolo (DTT), che rappresenta uno specifico reagente impiegato per la riduzione dei gruppi disolfuro a gruppi tiolici, è stata aggiunta ad un idrogel in cui era avvenuta la reticolazione: è stata osservata la sua completa dissoluzione (Lees & Whitesides, 1993). In letteratura è riportata una metodica di preparazione di un idrogel con Lipohyal® che consiste nel preparare 10 ml di una soluzione di Lipohyal® all’1.5% p/p in acqua distillata. La soluzione ottenuta viene poi trasferita in una piastra di Petri di diametro di 7 cm e sottoposta a radiazioni UV per un’ora (λ=254 nm; potenza=30 W; distanza 20 cm). È inoltre riportato che l’esposizione della soluzione alle radiazioni UV provoca un aumento della viscosità nell’ordine di 105

volte legato allo sviluppo di una rete tridimensionale. Questo fenomeno non si verifica se viene sottoposta alle stesse condizioni una miscela fisica di HA e LA (Sigma innovation in biomaterials InCosmetics 29-31 march 2011 ).

5.2 Messa a punto di formulazioni a base di Lipohyal®

La composizione delle formulazioni a base di Lipohyal preparate sono riportate in

tabella 16. Sono stati preparati 8 ml di una soluzione acquosa di Lipohyal® all’1.5% p/v

(idrogel 1) seguendo i dati riportati in letteratura (Carbohydrate Polymers 93, 2013 273- 278). E’ stato pesato il Lipohyal® in un becker e dunque aggiunta l’acqua distillata necessaria, mescolando con una bacchetta di vetro fino a completa idratazione della polvere. La soluzione veniva trasferita in una piastra di Teflon dal diametro di 5.5 cm livellando la superficie con la bacchetta in modo da renderla uniforme. La piastra di Teflon si è dimostrata più indicata rispetto alla piastra di Petri in quanto il gel non

aderiva alla sua superficie e si recuperava più facilmente, senza provocarne la rottura. La reticolazione della soluzione è stata realizzata utilizzando strumenti diversi in modo da valutare il suo comportamento alle radiazioni UV:

1) La prima prova è stata effettuata utilizzando una lampada germicida a raggi ultravioletti UV-C (λ=253.7 nm). La durata dell’esposizione è stata di 20 ore controllando lo stato di reticolazione ogni 4 ore per le prime 8 ore e al termine dell’esperimento.

2) La seconda prova è stata eseguita utilizzando una lampada UV per manicure (Röhren-Lichtärtungsgerät, tensione=230V;potenza=36W;frequenza=50Hz) ed esponendo la soluzione alle radiazioni UV per un’ora.

3) Per migliorare l’elasticità dell’idrogel è stato aggiunto alla formulazione un plasticizzante, la glicerina, in concentrazione dell’1% p/p (idrogel 2).

L’idrogel 2 e la reticolazione mediante lampada da manicure sono state scelte come procedura definitiva in quanto permettevano di ottenere l’idrogel con le caratteristiche migliori. Pertanto, sono state condotte delle prove per l’inserimento del tocoferolo acetato nell’idrogel. Il tocoferolo acetato risulta infatti particolarmente indicato poiché dotato di importanti proprietà in grado di esaltare ulteriormente gli effetti del Lipohyal®, come l’effetto antiossidante e anti-invecchiamento e l’azione emolliente ed idratante.

Lo scopo dello studio è quindi quello di ottenere un idrogel arricchito di sostanze in grado di svolgere un’azione protettiva e nutriente dell’unghia che, associate all’azione idratante e antiradicalica del Lipohyal®, lo rendano utilizzabile sia come ricostituente dell’unghia nel corso di manifestazioni patologiche sia come un’eventuale alternativa alle tecniche di ricostruzione ungueale che possono arrecarvi danno.

In un primo momento il tocoferolo acetato è stato inserito nella formulazione all’1% p/p (idrogel 3). Per favorire la sua solubilizzazione è stato impiegato l’etanolo ad una concentrazione di 1.8% p/p. Alla soluzione ottenuta veniva aggiunto il Lipohyal® e quindi la quantità necessaria di acqua. Come plasticizzante era usata la glicerina, introdotta nella formulazione dopo l’aggiunta dell’acqua. L’idrogel ottenuto è stato ritenuto idoneo per lo svolgimento di prove volte a valutare la capacità di rilascio del principio attivo da parte del prodotto.

5.3 Studio di rilascio del tocoferolo acetato dall’idrogel

Per lo studio di rilascio del principio attivo è stato utilizzato un cestello per saggio di dissoluzione di forme farmaceutiche solide, caratterizzato da un’estremità aperta ed un’estremità chiusa. L’estremità aperta permetteva l’introduzione del materiale da saggiare nel cestello e poteva essere collegata ad un’asse che ne permetteva la rotazione, mentre l’estremità chiusa aveva la funzione di mantenere il materiale introdotto in posizione e di consentire il contatto tra questo e la soluzione ricevente. All’interno del cestello sono stati introdotti 550 mg di idrogel 3 contenente 5.5 mg del principio attivo. Il cestello veniva quindi immerso in un becker contenente 15 ml di acqua distillata (fase ricevente) e dunque veniva avviata la sua rotazione ad una velocità costante. Prelievi di fase ricevente (aliquote da 5 ml) venivano effettuati ogni 30 minuti e sostituiti con un egual volume di acqua per mantenere le condizioni di sink. L’esperimento aveva una durata di 4 ore ed i campioni ottenuti erano determinati quantitativamente mediante HPLC seguendo il metodo analitico scelto per la determinazione del tocoferolo acetato. La prova è stata eseguita in triplicato.

Sono state quindi eseguite due diverse prove con lo scopo di favorire il rilascio del principio attivo da parte dell’idrogel:

1) Per favorire la solubilizzazione del tocoferolo acetato nella formulazione è stato utilizzato il Cremophor RH 40 ( PEG-40 Hydrogenated Castor Oil) al posto dell’etanolo (idrogel 4). Il Cremophor RH 40 fa parte della categoria dei tensioattivi non-ionici ed è un agente solubilizzante ed emulsionante largamente impiegato per solubilizzare sostanze idrofobiche in soluzioni idroalcoliche e soluzioni completamente acquose.

2) È stata aumentata la concentrazione di principio attivo nella formulazione dall’1%

al 5% p/p. Per favorire la solubilizzazione del tocoferolo acetato è stata aumentata anche la percentuale di etanolo al 5.2% p/p (idrogel 5). Il prodotto ottenuto è stato sottoposto a studi di rilascio con cestello seguendo le stesse modalità delle prove effettuate con l’idrogel 3 e descritte precedentemente. Anche in questo caso le prove sono state eseguite in triplicato e hanno avuto una durata di 4 ore ciascuna durante le quali venivano eseguiti prelievi di 5.0 di fase ricevente ogni 30 minuti. Il frammento di idrogel che è stato utilizzato per la prova aveva un peso di 0.60 g e conteneva lo 0.03% vitamina totale.

5.4 Studi di accumulo del principio attivo nella lamina ungueale bovina

Al fine di valutare se l’idrogel fosse in grado di rilasciare la vitamina all’interno dell’unghia è stato eseguito uno studio di accumulo del principio attivo nella lamina ungueale bovina. Per facilitare la dissoluzione del tocoferolo acetato nel mezzo ricevente è stato aggiunto il Brij 98 (Polyoxyethylene (20) oleyl ether) come solubilizzante. Per l’esperimento è stato impiegato un sistema spugnoso il quale veniva imbevuto di 3 ml di una soluzione di Brij 98 allo 0.01% p/v. Su di esso veniva fissata una lamina ungueale bovina di spessore 90-100 µm e peso 34 mg, precedentemente immersa in acqua distillata per 24 ore. Sulla lamina venivano fatti polimerizzare 0.1 g di idrogel contenenti 5 mg di vitamina E acetato (idrogel 5). Dopo un periodo di riposo di 20 ore in ambiente

occlusivo per non fare evaporare la soluzione acquosa dal sistema spugnoso è stata eseguita la macerazione dell’unghia. A tale scopo la lamina ungueale è stata perfettamente ripulita dall’idrogel e ridotta in piccoli frammenti, i quali sono stati inseriti in una eppendorf da 1,5 ml e bagnati con 250 µl di una soluzione acquosa di metanolo al 40%. Il campione preparato è stato lasciato riposare per 24 ore con lo scopo di ottenere la completa estrazione della vitamina eventualmente penetrata all’interno della lamina. Al termine delle 24 ore il campione è stato dapprima agitato su vortex, poi centrifugato ad una velocità di 13000 giri/min per 5 minuti e il surnatante è stato analizzato mediante HPLC. Inoltre, dal sistema spugnoso utilizzato come supporto, è stato recuperato il liquido che è stato analizzato mediante HPLC.

5.5 Prove di reticolazione dell’idrogel su lamine ungueali bovine

In questa fase di lavoro sono state valutate la capacità e la modalità di reticolazione della soluzione a base di Lipohyal® contenente il principio attivo direttamente su lamine ungueali bovine di spessore 90-100 µm. A questo scopo, 0.1 g di idrogel 5 sono stati posizionati su una lamina ungueale idratata in acqua distillata nelle 24 ore precedenti l’esperimento. La lamina è stata fissata su un supporto rigido che ha permesso di mantenere l’unghia distesa durante l’esposizione alle radiazioni UV: si è visto infatti che senza il supporto l’unghia tendeva a ripiegarsi su se stessa impedendo la reticolazione della soluzione. La reticolazione è stata effettuata utilizzando la lampada da manicure e la durata di esposizione alle radiazioni UV è stata di un’ora. In uno step successivo è stata valutata la possibilità di ottenere una reticolazione ottimale riducendo il tempo di esposizione alle radiazioni UV.

figura 14. reticolazione dell’idrogel su lamine ungueali bovine

5.6 Strategie formulative per evitare la disidratazione dell’idrogel

L’evaporazione di acqua dall’idrogel può portare alla formazione di uno xerogel, non idoneo allo scopo di questa tesi e ad un futuro sviluppo commerciale del prodotto.

Pertanto, al fine di ridurre la disidratazione del prodotto sono state effettuate diverse prove volte a schermare l’idrogel dall’ambiente esterno.

1) Il primo tentativo è stato quello di isolare l’idrogel 5 utilizzando un gel modellante