INFLUENZA DEI NANOWHISKERS DI CELLULOSA SULLE PROPRIETÀ MECCANICHE E SULLA

Il copolimero CopR, oltre che essere caratterizzato chimicamente e termicamente, è stato anche sottoposto ad analisi di tipo meccanico ed a idrolisi per investigare le proprietà d’interesse in campo biomedico. La conoscenza delle suddette proprietà è fondamentale per stabilire la possibilità di utilizzo o meno del composito nonché la sua collocazione in uno specifico campo di applicativo: suture bioriassorbibili o scaffold di durata variabile.

CopR100 280 357 301 357 305 358 -2,3 -0,7 CopR200 280 356 299 337 305 354 -2,3 -0,6

81 Per quanto riguarda le proprietà meccaniche, sono state effettuate prove statiche di trazione cioè il provino, a forma di osso di cane, viene sottoposto ad allungamento sotto trazione monoassiale a velocità costante, misurando il carico necessario a provocarne la rottura; la norma di riferimento è la ASTM D638. I campioni sono stati preparati mediante opportuno stampo al fine di ottenere la forma richiesta. La sezione deve essere necessariamente di forma rettangolare o circolare al fine di evitare che la frattura si “inneschi” nella zona di afferraggio dei morsetti. La procedura sperimentale è riportata al paragrafo 4.2.8.

Sono stati analizzati la matrice tal quale e i singoli compositi con le diverse percentuali di CNWs; per ogni tipo sono state effettuate tre prove da cui è stato poi ricavato il valore medio del modulo di Young (E). Di seguito sono riportati i grafici stress-strain per alcuni campioni e in tabella i valori medi di alcuni parametri significativi.

Tabella 18: proprietà meccaniche del CopR e composite dei bionanocompositi.

La presenza dei CNWs all’interno della matrice polimerica è chiaramente correlabile agli andamenti stress-strain ed inoltre, proprio grazie a questi risultati, si conferma una efficiente interazione all’interfaccia tra la matrice ed i nanocristalli.

In dettaglio, sono state valutate le variazioni di alcuni parametri significativi (Valori medi di quelli raccolti) come il modulo elastico (E), il carico di snervamento (

σ

_e), il carico massimo prima che si verifichi la strizione (

σ

_m), il carico a rottura (

σ

_r).

Campione

σ

e (Mpa) (ε%)

σ

m (Mpa) (ε%)

σ

r (Mpa) E (Mpa) Allungamento a rottura (ε%) CopR 1,1 (3,1) 2,4 (23) 5,4 25 342 CopR25 1,3 (3,4) 2,5 (24) 5,6 28 337 CopR50 3,0 (5,3) 4,6 (21) 8,6 52 320 CopR100 3,6 (5,6) 4,6 (18) 7,9 58 296 CopR200 4,0 (6,3) 4,8 (17) 8,3 66 305

82 In tutti i casi è possibile osservare sia un comportamento elastico che uno plastico dove si verifica la deformazione del provino. Considerando la regione elastica è possibile osservare un aumento progressivo del modulo elastico da un valore medio di 23 MPa, riferito al CopR, ad un valore di 55 MPa per il composito con il 2% di CNWs e inoltre il comportamento elastico si esplica in un intervallo di allungamento maggiore. È noto che i fattori capaci di influenzare il modulo elastico di un materiale sono l’eventuale presenza di fasi cristalline e/o di carica dispersa con buone interazioni con la matrice. L’aumento di cristallinità, per il PLLA puro, comporta però anche un aumento di fragilità del materiale. I nanowhiskers sembrano invece agire come punto di reticolazione che, oltre ad aumentare il modulo elastico, favoriscono una resistenza maggiore; si vede infatti che lo snervamento del provino si verifica con sforzi superiori riferiti però ad un allungamento maggiore (Tabella 18). Altro aspetto d’interesse, collegato a quanto detto prima, risiede nel fatto che per un incremento del modulo elastico del 260% ( campione al 2%) si ha una diminuzione dell’allungamento soltanto del 10%. Studi svolti da alcuni gruppi di ricerca, come quello dell’ UPV/EHU di Bilbao (Spagna)37, hanno mostrato che un incremento del modulo può essere ottenuto aumentando il contenuto di lattide nel copolimero; questo porta però ad una diminuzione notevole nell’allungamento a rottura. I nanowhiskers di cellulosa permettono quindi di ottenere un materiale più tenace, a parità di composizione, rispetto ad una matrice non caricata.

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 σ ( M P a ) ε (%) CopR CopR25 CopR50 CopR100 CopR200

83 Dal punto di vista dell’impiego di questo tipo di matrice polimerica per applicazioni per sistemi biocompatibili e bioriassorbibili, le proprietà degradative sono molto importanti. Durante l’ultimo decennio l’ingegneria tissutale ha sviluppato numerosi sistemi biocompatibili, generalmente a base di PLLA, capaci di degradare in vivo. I sistemi fino ad ora sviluppati risultano essere sensibili soltanto alla degradazione idrolitica mentre non risultano esserci enzimi, all’interno del corpo umano, capaci di degradarli.

Abbiamo pertanto valutato l’influenza del nanocristalli sulla degradazione idrolitica della matrice polimerica. Provini dello spessore di 0,1 mm e lunghezza 3 cm sono stati immersi in un tampone fosfato a pH= 7,4 e mantenuti a temperatura di 37 °C per tutto il tempo della prova. In questo modo si è creato un ambiente simile a quello di un organismo vivente. La degradazione è stata valutata collezionando i dati di perdita di peso settimanalmente per un tempo totale di sette settimane. Prima di effettuare le pesate, ogni campione è stato essiccato sotto vuoto al fine di rimuovere la soluzione tampone adsorbita e assorbita. Come già visto in precedenti lavori di letteratura35, sistemi a base di PLLA e PDLLA (Poli acido D,L-Lattico) degradano idroliticamente a seguito del loro rigonfiamento da parte dell’acqua e l’entità della degradazione è maggiore tanto maggiore è la porzione di materiale allo stato amorfo. Nel grafico seguente è rappresentato l’andamento della perdita di peso % nel corso dell’esperimento.

84 Si può osservare che, all’aumentare del contenuto di CNWs, diminuisce la perdita di peso percentuale. Questo fenomeno è riconducibile alle nanocariche che esplicano un effetto barriera ostacolando la penetrazione dell’umidità all’interno della fase amorfa. Tale effetto è dovuto probabilmente al fatto che i nanowhiskers creano un vero e proprio ostacolo fisico alla penetrazione dell’umidità, costringendola a compiere un percorso più complesso. Altro aspetto rilevante è collegato alle forti interazioni a idrogeno fra matrice e nanocariche che consentono la formazione di un network in cui le catene polimeriche hanno una minore mobilità e che si traduce quindi in una resistenza maggiore al rigonfiamento da parte dell’acqua. Cao X. Et al hanno visto un comportamento analogo in sistemi a base di polimeri termoplastici caricati con nanowhiskers.43 Analizzando in dettaglio la degradazione per i bionanocompositi, preparati in questo lavoro di tesi, si osserva che nelle prime quattro settimane si ha una diminuzione di peso simile per tutti i campioni e decrescente per % di CNWs maggiori ad esclusione di quello con lo 0,25% il quale degrada piu velocemente nelle prime settimane per poi stabilizzarsi nelle successive tre. Probabilmente, per bassi valori di nanowhiskers, il network con la matrice è meno omogeneo, rispetto ai campioni con contenuto di questi crescente, e quindi il rallentamento della degradazione è localizzato soltanto dove presenti i nanowhiskers e non omogeneo nell’intera matrice. Questa ipotesi è confermata anche dal fatto che, al diminuire del contenuto di nano cariche, i provini sono soggetti a frammentazione, la quale non si verifica per quelli a percentuali maggiori come ad esempio quelli al 2%. Nella tabella, presente al paragrafo della parte sperimentale, sono riportati i dati della perdita di peso e sono inoltre indicati quali sono i provini che si sono frammentati durante il monitoraggio della prova. Nell’ultima fase del monitoraggio si vede un incrememento marcato nella perdita di peso per il CopR e questo è una conseguenza della frammentazione dei provini poiché i derivati carbossilici, formatisi all’interno della massa del provino, e non in grado di raggiungere lo strato superiore44, una volta liberi nella soluzione catalizzano la degradazione idrolitica.

2.5.3 Osservazioni finali

In base ai risultati discussi nel paragrafo 2.5 è possibile affermare l’efficacia del metodo proposto per la preparazione di bionanocompositi a base del copolimero statistico P(CL-r-LLA) 30/70 e dei nanowhiskers di cellulosa. È stato visto che l’aggiunta dei nanowhiskers influisce sulle proprietà

85 termiche, meccaniche e di degradazione idrolitica della matrice. Ciò è possibile soltanto se è presente una efficiente dispersione/interazione di questi con la matrice polimerica.

Dalle analisi DSC è stato visto che la nano carica agisce direttamente sui domini ricchi in CL; la presenza dei CNWs induce la comparsa della Tg dei domini ricchi in CL ed inoltre all’aumentare del loro contenuto si ha un aumento nel valore della suddetta Tg a conferma della presenza di interazioni secondarie di questi con le unità di CL in catena. Per lo stesso motivo si ha un aumento anche nel valore di Tg della zona random. In ogni caso il materiale non vetrifica a 37°C perciò, nel corpo umano , manterrebbe la sua flessibilità.

È stato ipotizzato che i nanowhiskers interagiscono direttamente soltanto con i domini ricchi in CL (influenza sulla Tg) mentre la fase maggioritaria dei blocchi di LLA risente solo della loro presenza (lieve aumento del grado di cristallinità passando da copolimero puro a composito senza differenze apprezzabili per diversa % di nano carica). Questa ipotesi è rafforzata dai risultati ricavati dalle analisi termogravimetriche in quanto, per i domini dei blocchi di LLA, si ha un lieve aumento della temperatura di inizio degradazione in accordo con un contenuto maggiore di fasi cristalline. Nel caso invece dei domini random ricchi in CL, le interazioni fra CNWs e unità di CL rendono il meccanismo di degradazione più complesso che si traduce in una diminuzione della velocità di degradazione; diminuzione progressiva all’aumentare del contenuto di CNWs.

Dalle prove meccaniche di trazione è stato visto un effetto di rinforzo dei nanowhiskers sulla matrice, passando da un modulo elastico di 25 MPa a 66 MPa, effetto atteso in virtù del loro elevato modulo elastico di circa 130 GPa45; si ha inoltre un aumento del carico a snervamento (

σ

e)

associato ad allungamento percentuale maggiore che indica che i CNWs non infragiliscono il materiale.

In base hai dati raccolti durante le prove di degradazione si può osservare, soprattutto nelle ultime settimane, un effetto dei CNWs sulla velocità di degradazione. All’aumentare del contenuto della nanocarica la perdita di peso nel tempo diminuisce e inoltre con contenuti più elevati (2%) di non si verifica la frammentazione del provino; ciò sta ad indicare un’omogeneità delle interazioni nanowhiskers-matrice.

86

3.

CONCLUSIONI

Nella prima parte di questo lavoro di tesi è stato svolto uno studio preliminare sulla sintesi di poli(ε- caprolattone) PCL e poli(acido-L-lattico) PLLA mediante polimerizzazione per apertura di anello ROP, in presenza del sistema Sn(Oct)2/n-butanolo, osservando che, quando Sn(Oct)2 e n-butanolo

sono alimentati nei rapporti stechiometrici 1:1 ed 1:2, il peso molecolare della catena dipende linearmente dalla concentrazione del composto di stagno e può essere prevista con accuratezza all'interno del range di peso molecolare studiato (da 5.000 a 22.000 Dalton). Se invece l’alcol è aggiunto in eccesso rispetto allo stechiometrico, questo provoca una diminuzione del peso molecolare funzionando lui stesso come agente di trasferimento di catena e in questo caso non è possibile predire quindi il peso molecolare (che si abbatte notevolmente).

Successivamente è stata effettuata con successo e con buone rese (75-85%) la sintesi del copolimero a blocchi P(CL-b-LLA) con pesi molecolari diversi (15.000, 12.000 e 6.000 Da circa) e con terminazione ossidrilica sul blocco di LLA. La struttura a blocchi è stata confermata dalla analisi

1

H-NMR in cui è stato anche stato possibile verificare la presenza del gruppo terminale -CH(CH3)OH del blocco di LLA.

Dalle analisi DSC dei copolimeri a diverso peso molecolare si può osservare per tutti la presenza di due temperature di fusione riconducibili ai blocchi di LLA ( tra 43 e 50 °C) e di CL (tra 120 e 150 °C ) ed inoltre i valori delle temperature di fusione più bassi, assieme a gradi di cristallinità minori, rispetto ai rispettivi omopolimeri sono riconducibili alla elevata interfaccia tra i blocchi dei due comonomeri, legate chimicamente tra di loro, presente nel materiale con separazione di fase micrometrica.. Per quanto riguarda la stabilità termica, dalle TGA si osserva la presenza di due step degradativi (il primo fra 250 e 278 °C e il secondo fra 317 e 328 °C) riconducibili al blocco di LLA e di CL rispettivamente. Per quanto concerne la procedura di sintesi si è osservato che è preferibile alimentare i due monomeri in maniera sequenziale piuttosto che partire da PCL-monoolo come macroiniziatore, in quanto, sebbene la formazione del copolimero comunque avvenga, una presenza maggiore di umidità, in combinazione a eventuali tracce di metanolo intrappolate a seguito della fase di purificazione, porta alla formazione, accanto al copolimero, di catene di PLLA omopolimero a bassa massa molecolare.

Il gruppo ossidrilico terminale del copolimero a blocchi è stato quantitativamente trasformato in gruppo isocianato per reazione con TDI ed impiegato come sito reattivo per la successiva fase di funzionalizzazione dei nano cristalli di cellulosa. La reazione di innesto del copolimero a blocchi P(CL-b-LLA), modificato al terminale con il TDI, alla superficie dei CNWs è avvenuta con

87 successo facendo reagire in toluene il copolimero con peso molecolare intorno ai 6000 Da (CopB6) con i nanowhiskers trattati con ter-butanolo (Org-CNWs). Il successo dell’aggraffaggio dei nanowhiskers è stato confermato tramite microscopia elettronica (TEM) dove nelle immagini sono evidenti aggregati dei nano cristalli di piccole dimensioni (50-100 nm) immersi nella matrice. La degradazione termica (TGA) da informazioni riguardo l’avvenuto innesto del copolimero sulla superficie dei CNWs in quanto è possibile osservare una minore velocità di degradazione relativa al blocco di LLA nel Bionano rispetto a quella del CopB6 tal quale; i nanocristalli che degradano ad una temperatura maggiore rispetto al blocco di LLA probabilmente limitano le reazioni di degradazione della catena a cui sono aggraffati chimicamente. Le analisi DSC mostrano un aumento della temperatura di transizione vetrosa del blocco di CL dovuto alle interazioni all’interfaccia fra la matrice polimerica ed i nanocristalli in essa dispersi. Altro aspetto da considerare è la diminuzione del grado di cristallinità in quanto, per una efficiente dispersione, si ha una diminuzione delle dimensioni dei cristalliti dovuta al disordine strutturale indotto dalla presenza dei CNWs e che quindi limita l’organizzazione delle catene in domini cristallini. L’impiego del copolimero a blocchi P(CL-b-LLA) innestato sulla superficie dei CNWs ha anche lo scopo di migliorare la compatibilità fra le due fasi di PCL ed PLLA quando questi verranno impiegati come filler. Infatti, tentando di disperdere i CNWs tal quali, questi rimangono aggregati fra loro a causa di una bassa affinità con la matrice polimerica. Concludendo, la procedura di aggraffaggio del copolimero P(CL-b-LLA) alla superficie dei nanowhiskers può essere considerata una valida alternativa alla funzionalizzazione con approccio di tipo grafting from, presente in letteratura, ed inoltre è anche più versatile in quanto si può pensare di estenderla anche a polimeri e copolimeri di natura differente da quelli considerati in questo lavoro; basta che presentino un gruppo ossidrilico terminale.

Nella seconda parte di questo lavoro di tesi è stato sintetizzato con successo un copolimero random tra LLA e CL di composizione 70/30 con una buona resa (90%).

Dalla caratterizzazione 1H-NMR è emerso che la matrice polimerica non possiede caratteristiche totalmente random, avendo un indice di randomizzazione R pari a 0,53. Tale valore di R indica che la matrice polimerica è caratterizzata dalla presenza di lunghe sequenze di LLA e di una fase con prevalente distribuzione statistica delle unità comonomeriche in catena e più ricca in CL. L’analisi DSC del copolimero presenta una Tg a 71 °C riconducibile ai blocchi di LLA con il relativo picco di fusione e una Tg a 15 °C riconducibile ad una fase più ricca in CL. Dalla TGA si possono osservare due differenti temperature di degradazione apparteneti ai due tipi di domini di cui sopra.

88 La dispersione di nanocristalli di cellulosa nel copolimero (bionanocomposito) ne ha modificato sia le proprietà termiche che quelle meccaniche. Dalle analisi DSC è stato visto che la nanocarica interagisce maggiormente con i domini ricchi in CL; la presenza dei CNWs, infatti, induce la comparsa della Tg dei domini ricchi in CL,che non è rilevabile nel copolimero random tal quale, ed inoltre all’aumentare del loro contenuto si ha un aumento nel valore della suddetta Tg dovuto presubimilmente ad una maggiore incidenza di interazioni secondarie di questi con le unità di CL in catena. In ogni caso il materiale non vetrifica a 37°C perciò, nel corpo umano, manterrebbe la sua flessibilità. È stato ipotizzato che i nanowhiskers interagiscono direttamente soltanto con i domini ricchi in CL mentre la fase maggioritaria dei blocchi di LLA risente poco della loro presenza (lieve aumento del grado di cristallinità passando da copolimero puro a composito senza differenze apprezzabili per diversa % di nano carica). Questa ipotesi è rafforzata dai risultati ricavati dalle analisi TGA in quanto, per i domini dei blocchi di LLA, si ha un lieve aumento della temperatura di inizio degradazione in accordo con un contenuto maggiore di fasi cristalline. Nel caso invece dei domini ricchi in CL, le interazioni fra CNWs e unità di CL rendono il meccanismo di degradazione più complesso che si traduce in una diminuzione della velocità di degradazione; diminuzione progressiva all’aumentare del contenuto di CNWs.

In base hai dati raccolti durante le prove di degradazione dei campioni di bionanocomposito si può osservare, soprattutto nelle ultime settimane, un effetto dei CNWs sulla velocità di degradazione. All’aumentare del contenuto della nano carica, la perdita di peso nel tempo diminuisce e inoltre con contenuti più elevati (2%) di non si verifica la frammentazione del provino; ciò sta ad indicare un’omogeneità delle interazioni nanowhiskers-matrice, controllabile quindi con il contenuto di nanowhiskers.

Dalle prove meccaniche stress-strain si evince un effetto di rinforzo dei nanowhiskers sulla matrice, passando da un modulo elastico di 25 MPa a 66 MPa, effetto atteso in virtù del loro elevato modulo elastico di circa 130 GPa45; si ha inoltre un aumento del carico a snervamento (

σ

e) associato ad

allungamento percentuale maggiore che indica che i CNWs non infragiliscono il materiale.

In base ai risultati ottenuti si può affermare che un bionanocomposito come quello formulato in questo lavoro di tesi, ha delle potenzialità applicative nel campo biomedico. Infatti ,per quanto concerne le proprietà meccaniche questo presenta un modulo elastico dello stesso ordine di grandezza di quello dei tessuti morbidi (cfr introduzione tabella 1), perciò ha una potenziale applicabilità come impianto bioriassorbibile per la pelle o per le cartilagini articolari. Ovviamente

89 l’applicabilità in questo campo deve essere sostenuta da positive prove di biocompatibilità che comunque non erano nello scopo di questo lavoro di tesi.

Per quanto riguarda la degradazione idrolitica, considerando la matrice polimerica tal quale, una diminuzione della velocità di degradazione può essere ottenuta aumentando il contenuto di CL nel copolimero che però si traduce in un peggioramento delle proprietà meccaniche. Per questo motivo l’aggiunta dei CNWs può essere utile poiché permette di rallentare la velocità di degradazione e, allo stesso tempo, di migliorare le proprietà meccaniche della matrice. Anche in questo caso è necessarieo che in futuro vengano effettuate prove di biodegrabilità per poter impiantare questo materiale in organismi viventi.

90

4

PARTE SPERIMENTALE

4.1

Materiali

4.1.1

Monomeri e nanowhiskers

L-Lattide (LLA, Sigma Aldrich St. Luis USA, 98% ) è stato preventivamente essiccato sotto vuoto

per 5 h in presenza di un blando riscaldamento.

ε-Caprolattone (LLA, Sigma Aldrich St. Luis USA, 98% ) è stato anidrificato su CaH2 per 24h e

distillato sotto atmosfera inerte a pressione ridotta con successivo stoccaggio su setacci molecolari.

Nanowhiskers di cellulosa (CNWs, polpa di eucalipto, Bahia Pulp Company, Brasile ) preparati

presso il Departamento de Química – UFMG – MG (Brasile) tramite idrolisi acida con acido solforico e in seguito liofilizzati.

Nel documento SINTESI DI MATRICI POLIMERICHE A BASE DI ACIDO LATTICO E ε-CAPROLATTONE E LORO IMPIEGO PER LA PREPARAZIONE DI BIONANOCOMPOSITI CON NANOWHISKERS DI CELLULOSA (pagine 80-90)