Riprendendo ciò che è stato descritto nel capitolo 4, una delle caratteristiche adattative peculiari delle cellule tumorali e dei loro dintorni (in particolare nei tumori solidi) è la presenza di estese aree ipossiche. Tale condizione crea a livello cellulare una serie di risposte adattative, che sono il risultato diretto dell'intervento del fattore di ipossia inducibile (HIF-1). Esso ha tra i vari effetti quello di incrementare l’espressione genica dell’isoforma CA-IX, la quale riveste un ruolo importante nel mantenimento del pH all’interno delle cellule tumorali.
Infatti, a causa dell’aumentato metabolismo anaerobico attraverso la via glicolitica, si crea una condizione di acidità eccessiva per la sopravvivenza della
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massa tumorale, la quale riesce a compensare grazie ad alcuni trasportatori di membrana (come MCT e NHE-1) e alla CA-IX.
La CA-IX appartiene alla famiglia delle α-CAs umane molto attive e le sue proprietà catalitiche della reazione di idratazione della CO2 sono paragonabili a
quelle dell’isoforma II. Come per tutte le isoforme di α-CAs, anche la IX è suscettibile all’inibizione da parte di anioni, solfonammidi e sulfammati; in particolare sono state individuate e studiate alcune molecole attive nell’ordine del nanomolare[43]. L’anione della solfonammide (Ar-SO2NH-) si coordina con lo
Zn2+ situato all’interno della cavità del sito attivo, inibendo così l'attività catalitica dell'enzima α-CA. Questo gruppo funzionale è stato preso successivamente come base per la sintesi di svariati CAIs.
Recentemente, è stato dimostrato che Indisulam (composto 8, figura 3 e 31), un derivato solfonammidico originariamente chiamato E7070 con potente attività antitumorale, agisce come inibitore di CA-IX con affinità nell’ordine del nanomolare. Il suo meccanismo d'azione dettagliato non è chiaro, ma a seguito di un esperimento condotto da Fukuoka et al (2001), risulta coinvolto nella perturbazione del ciclo cellulare nelle fasi G1 e G2, nella down-regulation delle cicline, nella riduzione dell'attività della chinasi ciclina-dipendente 2 (CDK2), nell'inibizione della fosforilazione della proteina del retinoblastoma (pRb) e nell'espressione differenziata di molecole che partecipano all'adesione cellulare, ai segnali e alla risposta immunitaria, oltre alle sue proprietà inibitorie della CA- IX[44;45].
Figura 31: Composto E7070, noto come Indisulam[44].
Il problema principale di composti di questo tipo è la ridotta selettività nei confronti di CA-IX; infatti, essi sono affini anche per le isoforme CA-I e CA-II, le
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quali svolgono importanti funzioni fisiologiche, causando diversi effetti collaterali.
Gli isoenzimi CA-IX e -XII hanno delle caratteristiche che le distinguono dalle CA-I e -II. La principale differenza sta nel fatto che gli isoenzimi IX e XII sono proteine transmembranali che orientano il loro dominio catalitico fuori dalla cellula, mentre gli isoenzimi I e II sono proteine solubili localizzate all’interno della cellula, nel citosol. Quindi la strategia che è stata adottata per cercare di ottenere un’inibizione selettiva delle isoforme associate al cancro è stata quella di sintetizzare solfonammidi aromatiche con una minore capacità di diffondere attraverso la membrana fosfolipidica.
Alcuni studi hanno infatti evidenziato composti per i quali la membrana è impermeabile. Essi inibiscono specificamente le CAs associate alla membrana come l’isoforma IX: principalmente, questi composti comprendono solfonammidi caricate positivamente. Un approccio alternativo consiste nella progettazione di inibitori polimerici (ad alto peso molecolare), ma tali composti non sono molto utili in vivo a causa dei problemi connessi con i polimeri come reazioni allergiche e scarsa biodisponibilità[46]. Al fine di ottenere molecole di questo tipo utilizzabili in vivo per scopi clinici e diagnostici, è stato perseguito il primo approccio basato sulle solfonammidi altamente polari o salificate. Come molecola lead per studi fisiologici è stata utilizzata una solfonammide cationica, la QAS (Quaternary Ammonium Sulfanilamide, 65 in figura 32) che ha dimostrato un elevato effetto inibitorio sulle CAs di membrana di vari artropodi e pesci, ma presenta anche un’elevata tossicità per i vertebrati più evoluti.
65
Figura 32: Quaternary Ammonium Sulfanilamide[46].
Successivamente, a partire dalla molecola QAS 65, sono stati ottenuti alcuni CAIs (composti 66, 67, 68, 69, figura 33) con affinità nell’ordine del basso nanomolare
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per le isoforme II e IV. Inoltre, è stato osservato in alcuni studi in vitro su globuli rossi che queste molecole non sono capaci di oltrepassare la membrana citoplasmatica, discriminando in questo modo tra i vari isoenzimi a favore di quelli di membrana.
Quest’ultima caratteristica è di fondamentale importanza per lo sviluppo di inibitori selettivi per le isoforme IX e XII, in quanto esse sono maggiormente espresse sul lato extracellulare della membrana di molte cellule tumorali aggressive; di conseguenza, molecole di questo tipo bersagliano specificamente gli isoenzimi associati al tumore, senza influenzare le isoforme citosoliche note per svolgere importanti funzioni fisiologiche. Pertanto, questa classe di composti può costituire il punto di partenza per lo sviluppo di nuove terapie antitumorali basate sui CAIs[46].
Figura 33: Sali piridinici con effetti inibitori sulle CAs per i quali la membrana
citoplasmatica è impermeabile[46].
Un approccio alternativo per aumentare la solubilità e tollerabilità del farmaco, consiste nell’equipaggiare le molecole con parti di carboidrati a generare glicoconiugati. Questa strategia spesso non ha ricevuto una significativa attenzione presso le industrie farmaceutiche, in quanto gli zuccheri riducono la capacità di attraversare le membrane cellulari alle molecole cui sono legati. Wilkinson et al (2006) hanno invece deciso di provare a sfruttare questa caratteristica: servendosi della tecnica di Tail-Approach per generare potenti CAIs, hanno legato delle code di carboidrati al farmacoforo ad elevata affinità Ar- SO2-NH2, sintetizzando delle solfonammidi benzeniche glicoconiugate, al fine di
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Sono stati sintetizzati una serie di composti (70-77 in figura 34) che si sono rivelati molto attivi e selettivi verso la CA-IX grazie alla presenza della coda zuccherina.
Figura 34: Benzensolfonammidi glicoconiugate[47].
Un altro approccio per aumentare la selettività dei farmaci antitumorali nei confronti delle cellule tumorali, consiste nell'uso di profarmaci meno tossici che possono essere attivati selettivamente nel tessuto tumorale, sfruttando alcuni aspetti unici della fisiologia del tumore, come ad esempio l'espressione enzimatica di alcune isoforme presenti unicamente nelle cellule cancerose o l'ipossia.
Poiché la CA-IX è iperespressa nei tumori ipossici ed è presente in quantità molto basse solo in alcune parti del tratto gastrointestinale normale, questo enzima può costituire un bersaglio ottimale per la progettazione di profarmaci attivati dall’ipossia.
Ci sono, infatti, molti esempi nella letteratura riguardo ai profarmaci bioriduttivi ipossia-attivabili: essi vengono attivati grazie alla riduzione di chinoni, N-ossidi e nitroaromatici ad opera di enzimi endogeni o radiazioni. I primi CAIs di questo tipo furono progettati sfruttando le condizioni riducenti presenti in tali tumori, in cui la pO2 è generalmente inferiore all'1%. Sono stati sintetizzati alcuni derivati
disolfurici delle solfonammidi eterocicliche aromatiche (molecola 78 in figura 35) che, in linea di principio, dovrebbero essere eccessivamente voluminosi per riuscire a legarsi all'interno dello spazio ristretto del sito attivo di CA, il quale normalmente può ospitare solo una molecola di benzenesolfonammide o solfonammide eterociclica. In realtà, avviene una bio-riduzione, che può essere anche mediata dalla proteina riducente tioredoxina-1 (trovata ad alte concentrazioni in molti tipi di tumore umano), in cui il legame disolfurico viene
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scisso presso il tessuto tumorale, generando due tioli (molecola 79 in figura 35) meno ingombranti e quindi capaci di entrare all’interno del sito attivo dell’enzima CA per inibirlo mediante l’interazione con lo ione Zn2+[48]
.
78 79
Figura 35: 78 Profarmaco bioriduttivo ipossia-attivabile; 79 Tiolo derivante