nM per hCA-I) e 84a (K i di 78.2 nM per hCA-II), mentre valori di K i più

altalenanti sono stati riscontrati per l’isoforma legata alla membrana hCA-IV. Per chiarire le ragioni che spiegano l'attività e la selettività dei nuovi composti progettati, sono stati intrapresi studi di molecular docking per i ligandi 83c, 84c e

85c, scelti come composti rappresentativi delle tre serie. L'analisi dei risultati ottenuti ha rivelato che 83c, 84c e 85c chelano lo Zn(II) nel sito attivo attraverso l’atomo di azoto caricato negativamente della porzione benzensolfonammidica, analogamente a quanto osservato per le altre solfonammidi testate in complesso con le CAs. Inoltre, la solfonammide in ciascun composto è ben posizionata per formare un legame a idrogeno con il gruppo NH di T200. Oltre a queste interazioni condivise fra le molecole testate, la diversa struttura dello scaffold dei tre CAIs selezionati produce diversi modelli di interazione con il resto della struttura proteica dell’enzima. In particolare, 83c adotta preferibilmente una conformazione in cui i due atomi di azoto dell'anello pirimidinico accettano un

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doppio legame a idrogeno dalle catene laterali di Q71 e Q92 (come rappresentato in figura 42A)[61].

Figura 42: (A) Complesso 83c/hCA-IX. La molecola di inibitore è rappresentata

in colore arancio disposta all’interno della tasca del sito attivo sul fondo della quale è alloggiato l’atomo di Zn(II), rappresentato da una sfera grigia, che viene chelato da 83c[61].

Presumibilmente, la forte attrazione dovuta alla doppia interazione mediante legami a idrogeno potrebbe spiegare l'elevata affinità di 83c per hCA-IX. È interessante notare che l'anello fenilico pendente di 83c si trova alloggiato in una tasca idrofobica formata dai residui amminoacidici L91, L123 e V130. Questi amminoacidi appartengono alla cosiddetta regione “hot spot” la quale, essendo altamente variabile in termini di sequenza e conformazione tridimensionale all'interno di ogni isoenzima, svolge un ruolo chiave per la selettività dei vari CAIs[63]. A questo proposito, tenendo conto dell'attività inibitoria inferiore riscontrata per il composto 83c (figura 43B e C) nei confronti di hCA-I e hCA-II, si potrebbe ipotizzare che il sostituente fenilico, voluminoso e lipofilo, possa trovare difficoltà ad inserirsi nella cavità piuttosto stretta degli "hot spots" di questi ultimi due isoenzimi, riducendone così l’affinità[61]

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Figura 43: (B) 83c in complesso con l’atomo di Zn(II) all’interno del sito attivo

di hCA-I. (C) 83c in complesso con l’atomo di Zn(II) all’interno del sito attivo di hCA-II. In entrambi i casi la molecola di inibitore è raffigurata in arancione e la sua superficie in giallo[61].

Per quanto riguarda hCA-IV, tale isoforma presenta una regione "hot spot" costituita da residui piuttosto idrofili come N79, K95 ed E127, in cui il sostituente fenilico non trova punti di interazione favorevoli.

I composti 84c e 85c, indipendentemente dalla loro chiralità, condividono una modalità di legame comune (Figura 44D), formando, inoltre, delle interazioni idrofobiche di van der Waals con i residui Q92, V130, L199, T201 e P203. Questi dati indicherebbero l'indipendenza del legame dal tipo di enantiomero dei composti in questione. È interessante notare che una conformazione di legame simile è stata anche verificata sperimentalmente per gli altri ligandi co- cristallizzati con hCA-IX[63].

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Figura 44: (D) Sovrapposizione delle molecole 84c, in rosa, e 85c, in blu,

complessate con l’atomo di Zn(II), sfera grigia, all’interno del sito attivo di hCA- IX[61].

La porzione fenilica, inoltre, va a posizionarsi presso la stessa fessura idrofobica all’interno della regione "hot spot" descritta in precedenza. Quindi, la selettività di

84c e 85c per l’isoforma hCA-IX potrebbe anche essere ascritta alla difficoltà per

il sostituente fenilico, voluminoso e lipofilo, di inserirsi nella fessura di altre hCAs con regioni “hot spot” più idrofile. Il forte incremento della potenza mostrato dalla maggior parte dei derivati nell’inibizione di hCA-IX, in combinazione con i loro significativi profili di selettività, potrebbe risultare interessante per la progettazione di nuovi agenti antitumorali con effetti collaterali minori[61].

Il mio lavoro di tesi si colloca in un progetto più ampio che prevede di apportare modifiche strutturali ai composti tetraidroindazolici 84a-c e tetraidrochinazolici

85a-c, che, come precedentemente descritto, hanno dato risultati interessanti[61], al

fine di migliorarne il profilo farmacodinamico e farmacocinetico, mantenendo al tempo stesso l’effetto inibitorio selettivo sulla hCA-IX. Nello specifico sono stati razionalmente progettati derivati recanti un ulteriore arile variamente sostituito (composti 86 e 87 in figura 45) sulla porzione solfonammidica, che così diventa secondaria.

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86 87

R1 = R2 = H; R1 = R2 = CH3; R1 = H, R2 = C6H5

R3 = H, 4-OCH3, 4-Cl, 4-NO2, 4-CH3, 3-OCH3, 3-Cl, 3-NO2, 3-Cl

Figura 45: Nuove solfonammidi secondarie con nucleo tetraidroindazolico 86 e

tetraidrochinazolico 87.

Nei composti progettati è stato previsto di mantenere i sostituenti in posizione 6 (R1 = R2 = H; R1 = R2 = CH3; R1 = H, R2 = C6H5) dei due sistemi

tetraidroindazolico e tetraidrochinazolico per poter estendere le relazioni struttura- attività.

Sull’anello fenilico della solfonammide secondaria è stato previsto di introdurre, in varie posizioni (para e meta), sostituenti di varia natura (R = H, OCH3, Cl,

NO2, CH3) in grado di modulare l’acidità della solfonammide stessa, in analogia

con quanto descritto in letteratura[16].

In particolare, il mio lavoro di tesi si è incentrato sulla sintesi dei composti benzensolfonammidici secondari contenenti il nucleo tetraidroindazolico 86a-i (figura 46), ottenuti per arilazione dell’azoto solfonammidico del derivato 84c, sostituito in posizione 6 con un gruppo fenilico.

73 86a-i 86a: R3 = H 86b: R3 = 3-OCH3 86b: R3 = 4-OCH3 86c: R3 = 3-Cl 86c: R3 = 4-Cl 86c: R3 = 3-NO2 86d: R3 = 4-NO2 86c: R3 = 3-CH3 86e: R3 = 4-CH3

Figura 46: Derivati N-(aril)-4-(4-oxo-6-fenill-4,5,6,7-tetraidro-1H-indazol-1-il)-

benzenesolfonamidici 86a-i

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Schema 1

Condizioni di reazione e reagenti: i: DMF-DMA, 100 °C per 1 ora; ii: EtOH, 90

°C per 4-5 ore; iii: CH3CN, CuI, DMEDA, K2CO3, 100 °C per 8-24 ore

L’intermedio chiave è rappresentato dal 5-fenil-2-(dimetilamminometilen)-1,3- dione 89, che è stato sintetizzato secondo una procedura descritta in letteratura[64,65].

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Il derivato 5-fenil-1,3-cicloesandione 88, commercialmente disponibile, è stato fatto reagire con un eccesso di N,N-dimetilformammide dimetilacetale (DMF- DMA) a 100 °C, sotto costante agitazione, per un’ora monitorando l’andamento della reazione mediante T.L.C. (miscela eluente: etere di petrolio 40-60/acetato di etile = 1:9).

Dopo raffreddamento, per triturazione con etere etilico, si ottiene la precipitazione del composto desiderato 89 che viene raccolto mediante filtrazione a pressione ridotta. Il composto 89, ottenuto con rese quantitative, risulta sufficientemente puro da poter essere utilizzato come tale nello step successivo senza ulteriore purificazione.

Per l’ottenimento del derivato tetraidroindazolico 84c, il composto 89 viene poi fatto reagire, in etanolo a riflusso, con una quantità stechiometricamente equivalente di 4-solfonammidofenilidrazina cloridrato commerciale, secondo una procedura descritta in letteratura[55,61].

Dopo raffreddamento, si ottiene una sospensione che viene filtrata ottenendo il composto 84c, il quale è stato, in seguito, purificato mediante cristallizzazione da etanolo. Successivamente, 84c viene fatto reagire, in atmosfera di azoto con gli arilioduri opportunamente sostituiti 90a-i in acetonitrile, in presenza di CuI come catalizzatore, N,N’-dimetiletilendiammina (DMEDA), utilizzando K2CO3 in

eccesso come base.

La miscela di reazione viene scaldata a 100°C, sotto costante agitazione, per 8-24 ore, seguendo l’andamento della reazione mediante T.L.C. (miscela eluente: etere di petrolio 40-60/acetato di etile = 5:5). Dopo raffreddamento, la miscela viene diluita con acqua distillata, acidificata con HCl 2N, ed estratta con acetato di etile. Le fasi organiche sono poi state riunite, seccate su MgSO4 ed evaporate a

pressione ridotta, fornendo i composti grezzi 86a-i, successivamente purificati mediante cromatografia flash su gel di silice (diametro: 3 cm, altezza: 17 cm, miscela eluente: etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 5:5).

Tutti i composti finali ottenuti 86a-i, nonché tutti gli intermedi di reazione sono stati caratterizzati mediante dati analitici e spettroscopici e i dati sono risultati in accordo con le strutture proposte.

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I derivati 86a-i sono stati avviati a screening per essere saggiati quali inibitori catalitici delle isoforme hCA I-XIV presso il laboratorio del professor Supuran, C. T. dell’Università di Firenze.