A differenza della mTYR tetramerica, la tirosinasi umana monomerica (hTYR) è una proteina glicosilata legata alla membrana, con un contenuto di carboidrati del 13%.(rif.Art.principale) Per l'attività tirosinasica è necessaria la glicosilazione, e le sequenze amminoacidiche di hTYR e mTYR mostrano una similitudine solo del 23%. Rispetto alla mTYR, la tirosinasi umana hTYR è risultata 6 volte più potente per quanto riguarda l'attività di ossidazione di L- DOPA, e il valore di Km delle TYR umana e fungina per L-DOPA è, rispettivamente, 0.31 mM e 1.88 mM.(rif.Art.principale)
L'attività inibitoria dell'acido kojico è risultata 10 volte superiore per mTYR (IC50 = 53,70 µM) rispetto a hTYR (IC50 = 571,17 µM). Infatti, studi di binding hanno mostrato che l'acido kojico ha una più alta capacità di legame per mTYR (Ki = 4,3 µM) rispetto a hTYR (Ki = 350 µM).(rif.Art.principale) Inoltre, altri inibitori come la feniltiourea, la L-mimosina, l'acido cinnamico, l'acido benzoico e l'esculetina hanno mostrato differenze significative nelle attività inibitorie tra mTYR e hTYR. È importante notare che l'esculetina è un altro potente inibitore di mTYR, ma non ha mostrato nessuna attività inibitoria verso hTYR. Questi confronti mostrano come la tirosinasi umana hTYR sia unica e che l'identificazione di inibitori della tirosinasi umana sia di grande importanza.
Dal 1995, il derivato resorcinolico 4-butilresorcinolo (93, Fig. 15), è noto come potente inibitore della melanogenesi.(rif.Art.principale) Questo inibisce TYR e TRP-1, in vitro e nelle cellule di melanoma B16.(rif.Art.principale) Più precisamente, 93 esibisce una specificità
52 molto più elevata per TRP-1 rispetto a TYR.(rif.Art.principale) Recentemente, Lee e coll. hanno studiato il meccanismo di inibizione (116), e hanno evidenziato che il composto 93 inibisce la tirosinasi e la sintesi di melanina in maniera più efficace nelle cellule intatte rispetto ai lisati cellulari. Inoltre, in cellule B16 α-MHS-indotte, 93 inibisce completamente la tirosinasi cellulare, a 100 µM.
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54 Saggi Western blot e di trascrizione inversa-PCR hanno mostrato che il composto 93 riduce i livelli di tirosinasi, mentre non si osserva alcuna riduzione dei livelli di mRNA nelle cellule B16. Lo studio della modalità d'inibizione ha rivelato che il composto 93 inibisce la melanogenesi aumentando la degradazione proteolitica della tirosinasi e il legame competitivo alla tirosinasi. Come potente inibitore di hTYR, il composto 93 (IC50 = 21µM) produce un'inibizione completa della tirosinasi, a concentrazioni superiori a 100 µM. La potenza inibitoria di 93 è circa 20 volte superiore rispetto all'acido kojico (IC50 = 500 µM). Altri agenti sbiancanti comuni, come l'arbutina (IC50 = 6500 µM) e l'HQ (IC50 = 4400 µM), risultano scarsi inibitori di hTYR. In un modello di pelle con melanodermia, il composto 93 si è mostrato un inibitore molto potente, con un valore di IC50 pari a 13,5 µM. La potenza dei composti è la seguente: 93 (IC50 = 13,5 µM)> HQ (IC50 = 40µM)> acido kojico (IC50 = 400 µM).
Studi clinici hanno dimostrato l'efficacia e la sicurezza del composto 93 nel trattamento dei pazienti con melasma. Pazienti con macchie legate all'età sono stati trattati con una formulazione contenente 4- butilresorcinolo (93), 4-esilresorcinolo (94, Fig. 15) e 4- feniletilresorcinolo (95, Fig. 15). Tra questi, il composto 93 ha dato risultati promettenti per quanto riguarda l'inibizione della tirosinasi e ha ridotto la comparsa di queste macchie d'età nel range di 8 settimane, mentre i composti 94 e 95 hanno mostrato effetti significativi solo dopo 12 settimane.
L'output clinico del composto 93 sull'iperpigmentazione suggerisce che questo potrebbe rappresentare un inibitore promettente per il trattamento dei disturbi della pigmentazione. Infatti, nel trattamento
55 del melasma, è stata utilizzata una crema topica contenente lo 0,1- 0,3% di 93, che ha mostrato rapida efficacia, sicurezza e tollerabilità.(rif.Art.principale)
Il linderanolide B (96) e la subamolide A (97) sono due prodotti naturali che hanno dimostrato di essere capaci di inibire l'attività di mTYR (Fig. 15) (rif.Art.principale). A un dosaggio pari a 1 µM, sia il composto 96 che il 97 riducono il 50% delle attività della tirosinasi umana e inibiscono efficacemente (riduzione del 40%) la formazione di melanina nei melanociti epidermici umani (HEM), in un donatore neonatale moderatamente pigmentato (HEMn-MP). Nello zebrafish, questi due composti (a 10 µM) hanno prodotto una notevole riduzione nel livello di pigmentazione, rispettivamente di circa il 30% e il 25%, e non hanno mostrato alcuna tossicità.
Negli anni '30, sono state isolate le thujaplicine (isopropil cicloeptatrienoloni) e sostanze chimiche analoghe dalla Thuja plicata (Cedro rosso Occidentale).(rif.Art.principale).I tre regioisomeri α- tujaplicina (98), ß-tujaplicina (hinokitiolo, 99) e γ-tujaplicina (100) hanno mostrato potenti proprietà antifungine, antibatteriche e antiossidanti. Recentemente, le tujaplicine (isomeri α, ß e γ, 98-100, Fig. 15) sono state identificate quali potenti inibitori di hTYR e di mTYR. Nello specifico, le ß- e γ-tujaplicine (99 e 100) inibiscono in modo efficace l'attività di hTYR con valori di IC50, rispettivamente, pari a 8,98 e 1,15 µM, rispetto all'acido kojico (IC50 = 571,17 µM). L'ordine di potenza delle tujaplicine è risultato come segue: γ> ß> α- tujaplicina, con lo stesso ordine per quanto riguarda l'attività inibitoria di mTYR, con valori di IC50 ottenuti per γ (IC50 = 0,07 µM)> ß (IC50 = 0,09 µM)> α (IC50 = 9,53 µM). Tuttavia, è stata osservata un'enorme
56 differenza nelle attività inibitorie per hTYR e mTYR. Ad esempio, l'attività inibitoria dell'acido kojico è risultata di circa 11 volte più debole per hTYR (IC50 = 571,17 µM) rispetto a mTYR (IC50 = 53,70 µM). Le tujaplicine esplicano un'inibizione più debole di circa 105 volte (α-isomero), 100 volte (ß-isomero) e 17 volte (γ -isomero) nei confronti di hTYR rispetto a mTYR.
Gli auroni (Z-benzilidenebenzofuran-3(2H)-oni) sono presenti in natura e sono isomeri strutturali dei flavoni.(158) Nell'aurone, un gruppo simil-calcone è costretto in un anello a cinque termini, e vi sono due isomeri, con configurazioni E e Z. Okombi e coll. hanno studiato gli auroni presenti in natura e i loro analoghi quali inibitori di hTYR. Auroni con gruppi ossidrilici sull'anello A e con diversi sostituenti sull'anello B sono stati testati per la loro attività inibitoria difenolasica di hTYR. Le SAR hanno rivelato che gli auroni sono deboli inibitori di hTYR. Al contrario, i derivati degli auroni con due o tre gruppi ossidrilici, possibilmente in posizione 4, 6 e 4', inibiscono la tirosinasi di melanociti umani. In Fig. 15 sono riportati alcuni potenti inibitori (101-103). Tra questi, il 4,6,4'-triidrossiaurone (103), presente in natura, è risultato l'aurone più potente; questo induce un'inibizione del 75% a una concentrazione di 0,1 µM, ed è risultato più potente dell'acido kojico. Inoltre, lo studio del composto 103 su linee di melanociti ottenute da tre diversi individui con pelle bianca, scura e nera, non ha mostrato significative differenze nell'attività inibitoria. La valutazione dell'efficacia e della sicurezza di 103 in un modello animale ha dimostrato che il composto non presenta alcuna tossicità dopo somministrazione orale, a ratti, alla dose di 5 g/kg. Nei conigli, l'applicazione topica e oculare di 103 non ha evidenziato
57 alcuna irritazione significativa. I risultati indicano che questo potente inibitore di hTYR è probabilmente una molecola candidata per lo sviluppo di un nuovo agente sbiancante per la pelle.
La 2-idrossipiridina-N-ossido (HOPNO, 104, Fig.15), un mimetico del gruppo catecolico, è stata descritta in precedenza come un inibitore di mTYR a uno stato di transizione non naturale, con un valore della costante di inibizione competitiva (Kic) di 1,8 µM.(rif.Art.principale) Incorporando questa porzione di HOPNO nello scheletro dell'aurone, Haudecoeur e collaboratori dehanno sviluppato una nuova serie di auroni quali potenti inibitori di hTYR (rif.Art.principale). Essi hanno valutato anche gli effetti degli auroni sull'ossidazione di L-DOPA, ottenuta da cellule di insetti, da parte di hTYR. Dagli esperimenti, è risultato che i composti inibiscono l’enzima in modo competitivo (105-107, Fig. 15). In particolare, il composto 105 (Kic = 0,35 µM) è risultato l'inibitore più attivo rispetto agli altri analoghi (106, Kic = 1,02 µM e 107, Kic = 1,2 µM). Le SAR suggeriscono che il gruppo ossidrile in posizione 4 dell'aurone è un fattore chiave. Invece, la funzione HOPNO fornisce un inibitore molto debole nei confronti di hTYR, con un valore Ki di 128 µM, che risulta circa 350 volte più alto rispetto al valore misurato per il composto 105, un potente inibitore di mTYR, con un valore di IC50 di 1,5 µM (rif.Art.principale). Questi dati sottolineano il ruolo cruciale dello scheletro dell'aurone ai fini di una potente attività inibitoria di hTYR. Ulteriori indagini su un modello cellulare umano (cellule del melanoma MNT-1 umano), evidenziano che gli auroni ibridi prevengono la melanogenesi nell'ambiente citoplasmatico umano, con una potenza d'inibizione analoga a quella ottenuta con il saggio di
58 inibizione della tirosinasi isolata. Ad esempio, il composto 105 ha registrato un valore di IC50 inferiore (IC50 = 16,6 µM) rispetto ai composti 106 (IC50 = 30µM) e 107 (IC50 = 30µM) (Fig. 15). Nelle cellule intere di MNT-1, sono state riscontrate attività inibitorie della melanogenesi da parte dei composti che sono 3,5-5 volte più alte di quelle ottenute nei lisati. Ad esempio, il composto 105 ha mostrato una potente inibizione, con un IC50 di 85,3 µM, 119 µM per 107, e 120 µM per 106. Gli autori suggeriscono che la scarsa capacità dei composti 105-107 di attraversare le cellule MNT-1 è probabilmente dovuta alla natura zwitterionica del gruppo HOPNO. Tuttavia, il composto 105 è, ad oggi, il più potente inibitore della tirosinasi umana. È interessante ricordare che l'acido kojico, l'inibitore di riferimento, è risultato praticamente inattivo sia su lisato che sulle cellule intere.
L'acido p-cumarico (PCA, 108, Fig. 15), un metabolita secondario comune ottenuto dalle piante, è ampiamente distribuito in verdura, frutta e funghi. Il composto 108 (PCA) e i suoi analoghi sono associati a molte proprietà biologiche tra cui il loro potenziale depigmentante, l'attività antiossidante, anti-collagenasi, antimicrobica e antiinfiammatoria (rif.Art.principale). La struttura chimica di 108 è risultata interessante per la sua stretta somiglianza con la tirosina, un substrato naturale della tirosinasi. Infatti, 108 è descritto come un potente inibitore di mTYR, in quanto compete con la tirosina per i siti attivi della tirosinasi (rif.Art.principale). An e coll. hanno descritto il composto 108 come potente inibitore della melanogenesi in cellule di melanoma murino stimolato con α-MSH.(117) Il composto 108 è risultato maggiormente capace di inibire la formazione di melanina
59 cellulare rispetto a composti strutturalmente simili come l'acido 3-(4- idrossifenil)propionico, l'acido cinnamico e l'acido caffeico.(67) Questi risultati indicano che il composto 108 possiede le caratteristiche strutturali adatte per l'inibizione della melanogenesi cellulare (rif.Art.principale).
In uno studio successivo, Song e coll. hanno valutato l'attività inibitoria di 108 e del suo estere metilico (MPA, 109, Figura 15) in una linea di HEM.(118) I risultati hanno mostrato che 108 è un potente inibitore della tirosinasi, con un valore IC50 di 3 µM, mentre 109 (MPA) risulta quasi inattivo (IC50 = 30µM). Inoltre, sono state preparate creme semisolide per dimostrare il potenziale cosmeceutico di questi due composti, 108 e 109. Per gli studi di permeazione cutanea dei composti, è stata utilizzata, come modello, la pelle suina ed è stata valutata la biodisponibilità transdermica. Il composto 108 è capace di attraversare le membrane biologiche, mentre 109 non ha dato lo stesso risultato. L'applicazione topica di 108 come crema attenua la formazione di eritema indotto da raggi UVB e la pigmentazione in modelli murini, ed è risultato più efficace rispetto a MPC in crema.
An e coll. hanno valutato l’attività inibitoria di 108 su diverse TYR fungine, murine e umane e hanno confrontato i dati con quelli di arbutina e acido kojico, presi come composti riferimento.(119) Il composto 108, rispetto all'acido kojico e arbutina, ha mostrato una debole inibizione nei confronti di mTYR, ma una più forte inibizione nei confronti della TYR umana e murina. L'analisi della cinetica enzimatica ha indicato che il composto 108 esercita un’inibizione nei confronti di hTYR di tipo misto (per la tirosina) o competitivo (per
60 DOPA). La rilevanza fisiologica dell'inibizione di hTYR da parte di 108 è stata studiata nella linea HEM esposta a UVB. I risultati mostrano che 108 inibisce la melanogenesi e la perdita di vitalità nei melanociti umani indotta dall'irradiazione UVB se usata prima dell'irradiazione (pretrattamento), mentre durante il post-trattamento inibisce solo la sintesi di melanina. I risultati hanno anche indicato che il composto 108 potrebbe essere un potenziale candidato per lo sviluppo di un agente ipopigmentante, in quanto inibisce sia la sintesi di melanina che la citotossicità indotta da UVB.
Seo e coll. hanno condotto uno studio in vivo usando 108 in forma di crema (CR90416F10LHJ, Snow White cream, Cosmax, Seoul, Corea) contenente l'1,5% di 108, come agente sbiancante nell'uomo (120). I risultati hanno mostrato che 108 riduce la formazione di eritema indotta da UV e la successiva pigmentazione nella pelle umana.