Nello sviluppo di nuovi agenti antitumorali, ha destato grande interesse il ruolo chiave del mitocondrio come mediatore della sopravvivenza e della morte cellulare, data la sua funzione di centro di integrazione degli stimoli pro- ed anti- apoptotici.
Questo organello assume una significativa rilevanza terapeutica, in quanto le sue disfunzioni portano a processi apoptotici inadeguati, e ad iperproliferazione delle cellule tumorali.
Alcune disfunzioni mitocondriali sono caratteristiche dell’apoptosi e tra queste un ruolo chiave è giocato dall’Induzione della permeabilità mitocondriale (MPT), un processo che porta ad un aumento della permeabilità della membrana interna verso soluti con una massa molecolare superiore a 1500 Da. Questo fenomeno è regolato dall’apertura di canali di conduzione conosciuti come poro di transizione di permeabilità. L’apertura di questo poro non selettivo, provoca la dissipazione del potenziale della membrana interna, rigonfiamento della matrice, rottura della membrana esterna che porta al rilascio di attivatori delle caspasi, come il cyt C, che innesca le vie pro-apoptotiche, portando alla frammentazione del DNA. Interessante è il ruolo della proteina p-53, una proteina che induce un aumento dei livelli di BAX, una proteina pro-apoptotica tipica dei mammiferi, che ha come bersaglio la membrana mitocondriale e porta al rilascio di cyt C. Una volta nel citoplasma il cyt C interagisce con altre proteine formando il cosiddetto “aptosoma”. Questo richiede la partecipazione, oltre che del cyt C, di APAF-1 (il quale lega ATP) e della caspasi-9, che, insieme, inducono l’attivazione della pro- caspasi-3. Questa, a sua volta, attiva la caspasi-3 che attiva i fattori di frammentazione del DNA (DFF) e di conseguenza attiva le endonucleasi. Questi
processi portano a cambiamenti biochimici e morfologici comunemente riconosciuti nella cellula come apoptosi.
Alcuni farmaci antitumorali convenzionali, usati comunemente in clinica hanno mostrato un’azione diretta, ed in alcuni casi specifica, sui mitocondri in aggiunta ad i loro effetti citosolici o nucleari.
Infatti è stato stabilito che la cardiotossicità e la resistenza incrociata di antracenodioni ed antracicline ed è stata attribuita al loro accumulo nelle membrane lipidiche mitocondriali, ed alla conseguente attività ossidoriduttiva della funzione chinonica.
Alcuni farmaci antitumorali che hanno come bersaglio le Topoisomerasi-II come Etoposide ed Asmacrina, hanno mostrato la loro capacità di interagire con le funzioni mitocondriali, anche con meccanismi correlati alla formazione del poro di transizione di permeabilità. Tuttavia la maggior parte dei farmaci antitumorali non berasagliano direttamente i mitocondri, ma colpiscono prima altri target molecolari per generare i segnali che successivamente innescano l’apoptosi. Queste osservazioni possono contribuire alla ricerca di composti capaci di interagire con le funzioni mitocondriali, per sviluppare nuovi derivati antitumorali con danni al DNA minimi pur mantenendo l’efficacia per cellule tumorali MDR.
Il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto la mia tesi sperimentale di laurea si è sempre dedicato alla preparazione di nuovi agenti antiproliferativi, studiando ampiamente alcuni cromofori policiclici [26-28], e tra questi è stata recentemente descritta la 2-ammino-5H-pirido-tiopiranopirimidina (PTP) I che ha mostrato una buona attività citotossica su due linee di cellule tumorali umane (HeLa e HL-60) e
questa attività è stata attribuita alla sua capacità di interagire con le funzioni mitocondriali [29]. N S N N NH2 I
In questo contesto sono state effettuate delle modifiche sullo scaffold I, ottenendo prima il derivato isosterico II (R = NH2), risultato privo di attività. Sostituendo il
gruppo amminico con un gruppo fenilico il composto II (R = C6H5) ha mostrato
un’apprezzabile attività citotossica sulle cellule HL-60 [30].
S N N R H3CO II
Recentemente [31] sono stati descritti i benzotiopiranopirazoli in cui in posizione 1 del sistema cromoforo è stata inserita una funzione arilica pendente a dare i derivati 1a-f.
S N N R X 1a-f 1a: R = OCH3 X = H 1b: R = Cl X = H 1c: R = OCH3 X = OCH3 1d: R = Cl X = OCH3 1e: R = OCH3 X = Cl 1f: R = Cl X = Cl
L’attività antiproliferativa dei nuovi derivati benzotiopiranopirazolici è stata valutata su due linee cellulari umane HeLa (Adenocarcinoma della cervice uterina) ed HL-60 (Leucemia Mieloide). I risultati (espressi come IC50, ovvero
che la concentrazione µΜ del composto che causa la morte del 50% delle cellule in coltura) hanno indicato un significativo effetto antiproliferativo per i derivati 1a e 1c, che sono caratterizzati dalla presenza di un gruppo metossilico in posizione 7 dello scaffold. In particolar modo 1e, è risultato il più attivo in entrambe le linee cellulari, mostrando un valore IC50 nel basso range del micromolare..
Per esercitare un significativo effetto antiproliferativo, i benzotiopiranoopirazoli necessitano della presenza di un gruppo fenilico, preferibilmente p-clorosostituito, in posizione 1 della struttura eterociclica. Inoltre un ruolo importante è giocato dalla presenza del gruppo metossi in posizione 7, infatti la sua sostituzione con cloro comporta una sensibile diminuzione della sua attività biologica.
Le cellule HeLa trattate con 1e, mostrano una evidente depolarizzazione della membrana mitocondriale, simile a quella indotta da H2O2 già descritta in
letteratura[32]. Inoltre questi risultati in tutte le cellule, confermano che l’effetto mostrato da 1e avviene mediante uno stress ossidativo.
In conlusione, il nuovo derivato benzotiopiranopirazolico 1e, attivando le vie apoptotiche tramite il danno alle funzioni mitocondriali, manifesta l’effettiva azione antiproliferativa sulle linee cellulari tumorali. Per queste ragioni, il nucleo benzotiopiranopirazolico costituisce un cromoforo che potrebbe essere sviluppato per la ricerca di nuovi agenti terapeutici antitumorali.
Proseguendo le ricerche in questo campo, lo scopo della mia tesi è stato quello di sintetizzare gli analoghi dei derivati pirazolici appena descritti nei quali però la funzione fenolica sostituita è stata inserita in posizione 2 dello scaffold.
S N N R X 2a-f 2a: R = OCH3 X = H 2b: R = Cl X = H 2c: R = OCH3 X = OCH3 2d: R = Cl X = OCH3 2e: R = OCH3 X = Cl 2f: R = Cl X = Cl
Sintesi dei derivati benzotiopiranopirazolici 2-aril sostituiti
La sintesi impiegata nella preparazione dei composti 2a-f ha coinvolto, come primo passaggio, la preparazione dei composti 7-metossi-2,3-diidro-1-
benzopiran-4(4H)-one 3a ed il 7-cloro-2,3-diidro-1-benzotiopiran-4(4H)-one 3b già descritti [33] S O R 3a-b a: R = OCH3 b : R = Cl
I composti 3a e 3b sono stati ottenuti con due sintesi differenti illustrate rispettivamente nello schema 1 e nello schema 2.
Schema 1 S O H3CO SH H3CO H3CO SCH2CH2COOH i ii 4 3a
Reagenti e condizioni: i: acido 3-bromopropionico in NaHCO3 soluzione acquosa e
NaOH 10% 100°C, 3h; ii: PPA, 120°C, 3h.
Un eccesso di acido 3-bromopropionico in una soluzione satura di bicarbonato di sodio è stato aggiunto ad una soluzione di 3-metossitiofenolo in una soluzione acquosa al 10% di idrossido di potassio. La miscela di reazione è stata sottoposta ad agitazione a 100°C per 3 ore, raffreddata ed acidificata con acido cloridrico concentrato fino a pH=4. Il solido precipitato è stato raccolto tramite filtrazione e lavato con acqua per ottenere il corrispondente acido tiopropionico 4 puro con una
buona resa; questo, per trattamento con acido metansolfonico, ha dato il 2,3- diidro-1-benzopiran-4(4H)-one grezzo 3b, che è stato purificato tramite cristallizzazione (Schema 1). Schema 2 S O Cl SH Cl Cl SCH2CH2COOH i ii 5 3b
Reagenti e condizioni: i: acido 3-bromopropionico in NaHCO3 soluzione acquosa e
NaOH 10% 100°C, 4h, ii: H2SO4 75°C, 2h.
Un eccesso di acido 3-bromopropionico in una soluzione satura di bicarbonato di sodio è stato aggiunto ad una soluzione di 3-clorotiofenolo in una soluzione acquosa al 10% di idrossido di potassio. La miscela di reazione è stata sottoposta ad agitazione a 100°C per 4 ore, raffreddata ed acidificata con acido cloridrico concentrato fino a pH 3. Il solido precipitato è stato raccolto tramite filtrazione e lavato con acqua per ottenere il corrispondente acido tiopropionico puro 5, con una buona resa, che per trattamento con acido solforico ha dato il 2,3-diidro-1- benzotiopiran-4(4H)-one grezzo 3c, che è stato purificato tramite cristallizzazione (Schema 2).
Gli α-idrossimetilenderivati 6a-e, hanno successivamente rappresentato gli intermedi chiave per la preparazione di tutti i nuovi derivati di tipo tiopiranopirazolico 2a-f.
S O CHOH R 6a-b 6a: R = OCH3 6b: R = Cl
I tiopiranoni 3a-b vengono formilati in buone rese a 6a-b, seguendo una metodica analoga a procedure riportate in letteratura. [34,35]Per reazione con formiato di etile, in presenza di metilato di sodio in rapporto rispettivamente 1: 2: 2 in soluzione toluenica anidra (Schema 3), sono ottenuti i composti 6a-b, sufficentemente puri da potere essere utilizzati come tali nelle reazioni successive.
Schema 3 S O R S O CHOH R MeONa HCOOEt Toluene 3a-b 6a-b a: R=OCH3 b: R=Cl
Prendendo in considerazione la preparazione dei derivati pirazolici 1a-f sostituiti in posizione 1 dell’anello pirazolico precedentemente sintetizzati [31]; questi sono stati ottenuti per condensazione diretta tra gli intermedi 6a-b e fenilidrazina p- sostituita cloridrato. Dai dati riportati in letteratura[36] relativi alla sintesi di altri derivati pirazolici, era stato evidenziato che dalla miscela di reazione condotta a freddo si ottenevano i fenilidrazoni intermedi, mentre dalla miscela di reazione
condotta a caldo, si ottengono esclusivamente i pirazoli. Si può supporre che anche in quel caso il derivato fenilidrazono-metilenico era l’intermedio, che per ciclizzazione ha fornito il prodotto desiderato sotto forma di cloridrato dal quale viene liberata la base per trattamento con K2CO3. Bisogna altresì sottolineare che,
nella miscela di reazione era stata sempre riscontrata la presenza di un solo prodotto e non di due pirazoli isomeri; grazie alla maggiore reattività del gruppo idrossimetilenico dei derivati 6a-b, rispetto al gruppo chetonico, che è stata accertata sulla base di reazioni riportate in letteratura [35], riguardanti la formazione di enamine su tale gruppo. Sulla base di tali considerazioni, vista la più alta reattività nucleofila dell’atomo di azoto in beta rispetto a quello in alfa della fenilidrazina, il gruppo fenilico era stato appunto attribuito alla posizione 1 e non alla posizione 2 nei derivati 1a-f. [31]
Per la sintesi dei corrispondenti pirazoli sostituiti in posizione 2 è stato invece necessario sintetizzare i derivati 7a-b in cui la funzione idrossimetilenica, più reattiva del gruppo chetonico, è stata protetta con un gruppo p-toluensolfonico, [37]. S O CHOSO2 R CH3 7a-b 7a: R=OCH3 7b: R=Cl
La sintesi dei prodotti 7a-b viene effettuata a partire dagli opportuni α- idrossimetilenderivati 6a-b (Schema 4) in soluzione di tetraidrofurano anidro, per
addizione con una quantità stechiometricamente doppia di p-toluensolfonilcloruro e un forte eccesso di K2CO3. La miscela di reazione viene tenuta in agitazione per
15 ore a temperatura ambiente e per 15 ore a riflusso controllandone l’andamento mediante TLC (miscela eluente: Etere di petrolio/AcOEt 7: 3).
Dopo raffreddamento, la sospensione ottenuta viene portata a secco, trattata con H2O e successivamente estratta con CHCl3. La fase organica è quindi evaporata a
secchezza ed il residuo ottenuto è purificato mediante cromatografia flash su colonna di gel di silice.
Schema 4 S O CHOH R S O CHOSO2 R CH3 + ClO2S CH3 THF, ∆ 6a-b 7a-b a: R=OCH3 b: R=Cl
Successivamente, facendo reagire gli intermedi 7a-b con l’opportuna fenilidrazina cloridrato p-sostituita, è stato tentato di ottenere i derivati 2-fenil sostituiti desiderati come riportato nel seguente schema 7.
Un leggero eccesso di p-cloro o p-metossifenilidrazina cloridrato viene addizionato ad una soluzione di 0.003 moli dell’opportuno derivato 7a-b in 10 ml di DMF. La miscela di reazione è tenuta per 24 ore in agitazione a temperatura ambiente e successivamente posta a riflusso per 15 ore, controllandola mediante TLC. I prodotti finali ciclizzati 2a-f ottenuti come composti grezzi, sono stati purificati mediante cromatografia flash su colonna di gel di silice utilizzando l’opportuna miscela eluente, (tabella I), (Schema 5).
Schema 5 S O CHOSO2 R CH3 + H 2NHN X HCl DMF, ∆ S R N N X 2a-f 7a-b 2a: R = OCH3 X = H 2b: R = Cl X = H 2c: R = OCH3 X = OCH3 2d: R = Cl X = OCH3 2e: R = OCH3 X = Cl 2f: R = Cl X = Cl
Al momento della stesura di questa tesi sono stati ottenuti e caratterizzati i composti 2a-c e 2e.
L’attività biologica dei nuovi composti pirazolici sintetizzati sarà valutata grazie alla collaborazione con il gruppo di ricerca dell’Università di Padova.
Tabella I
Caratteristiche chimico-fisichee spettroscopiche dei derivati 2-(p-fenilsostituiti)-1,4-tiopirano pirazolici 2a-f
S N N R X Analisi elementare (%) Calc./trov. N R X Resa (%) P.f. (°C) (solv. crist.) 1 H nmr (δδδ ppm) δ Formula C H N
2a OCH3 H 45.1 110-115 3.78 (s, 3H, OCH3); 4.09 (s, 2H, CH2-S); 6.85 (dd, 1H, ArH); 6.94 (d, 1H, ArH); 7.30 (t, 1H, ArH); 7.51 (t, 2H, ArH), 7.81- 7.87 (m, 3H, ArH); 8.37 (s, 1H, ArH)
C17H14N2OS 69.36
69.29 4.79 4.75 9.52 9.49
2b OCH3 OCH3 30.6 108-112 3.78 (s, 3H, OCH3); 3.80 (s, 3H, OCH3); 4.07 (s, 2H, CH2-S); 6.83 (dd, 1H, ArH); 6.93 (d, 1H, ArH); 7.06 (d, 2H, ArH); 7.75 (d, 2H, ArH), 7.60 (d, 1H, ArH); 8.25 (s, 1H, ArH)
C18H16N2O2S 66.64
66.56 4.97 4.93 8.64 8.61
2c OCH3 Cl 30.17 88-93 3.78 (s, 3H, OCH3); 4.08 (s, 2H, CH2-S); 6.84 (dd, 1H, ArH); 6.94 (d, 1H, ArH); 7.56 (d, 2H, ArH); 7.83 (d, 1H, ArH), 7.88 (d, 2H, ArH); 8.40 (s, 1H, ArH)
C17H15N2OSCl 62.10
61.97 3.98 3.94 8.52 8.48
2e Cl OCH3 25.8 167-169 3.82 (s, 3H, OCH3); 4.02 (s, 2H, CH2-S); 7.05-7.10 (m, 3H,
ArH); 7.28 (d, 2H, ArH); 7.54 (d, 1H, ArH), 7.62 (s, 1H, ArH) C17H15N2OSCl
62.10