Foto 1 Una femmina di P concolor nell’atto d
6. IPOTESI SPERIMENTALE: I FEROMONI SESSUALI DI B.oleae COME CAIROMONI PER P concolor
Tutte le creature che vivono come predatori, parassiti o parassitoidi vedono la loro
esistenza legata alla presenza di altre specie e, dunque, per sopravvivere devono essere
in grado di rintracciare tali specie. Nel corso dell’evoluzione questi animali hanno
imparato a sfruttare a proprio vantaggio ogni tipo di segnale rilasciato nell’ambiente
dalle proprie prede. Spesso parassitoidi e predatori hanno imparato a riconoscere ed
utilizzare, per la propria ricerca, tutti quei particolari segnali emessi dai loro ospiti o
prede durante il periodo dell’accoppiamento (Zuk e Kolluru 1998; Bruce et al. 2001).
Esistono molte prove dello sfruttamento dei comportamenti sessuali di natura acustica.
Ad esempio le melodie emesse durante il corteggiamento da gryllidi e gryllotalpidi
attraggono alcuni ditteri tachinidi (Mangold 1978; Allen 1995), come anche il canto di
corteggiamento dei cicadidi è utilizzato per la localizzazione da ditteri sarcophagidi
(Soper et al. 1976). Più rari sono i casi in cui predatori e parassitoidi si servono di
segnali visivi d’accoppiamento, come la luminescenza emessa dai maschi di lucciola
Photinus sp. durante il corteggiamento seguita dalle femmine del suo predatore Photuris sp. (Lloyd e Wing 1983; Lloyd 1997), o ad esempio la colorazione del
maschio del pesce tropicale d’acqua dolce, detto guppy, Poecilia reticolata che attrae
molti predatori oltre al gambero Macrobrachium crenulatum (Endler 1978, 1991). Si
può comunque dire, soprattutto per gli insetti entomofagi, che il tipo di stimolo di
natura sessuale più utilizzato sia quello olfattivo (Zuk e Kolluru 1998). Da questo punto
di vista sono molto interessanti le vespe parassite che ricercano i loro ospiti
riconoscendo sia stimoli olfattivi prodotti dall’ospite allo stadio in cui esso viene
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pianta ospite (Fatouros et al. 2008). Ad esempio, i parassitoidi che depongono
all’interno di uova di altre specie hanno sviluppato la capacità di servirsi dei feromoni
dell’ospite adulto come cairomoni di ricerca per compensare la loro scarsa abilità nel
rintracciare le uova stesse. In altre parole, questi animali cercano la presenza dell’ospite
allo stadio adulto per identificare un’area in cui molto probabilmente, essendoci
l’adulto, ci siano anche uova (Huigens e Fatouros 2013 e loro referenze). Più in
generale i parassitoidi sono spesso in grado di distinguere diversi tipi di feromoni
emessi dal proprio ospite allo stadio adulto come feromoni d’allarme (ne sono esempi
quelli di formiche ed afidi) (Feener et al. 1996; Micha e Wyss 1996; Beale et al. 2006),
d’aggregazione (Aldrich et al. 1984; Bruni et al. 2000), anti-sessuali (o anti-afrodisiaci)
(Fatouros et al. 2005; Huigens et al. 2009, 2010) e, ovviamente, sessuali. In particolare
i feromoni sessuali degli ospiti adulti suscitano attrazione in molte specie di imenotteri
parassiti, compresi afelinidi (Sternlicht 1973; Kyparissoudas 1987; Samways 1988;
McClain et al. 1990), encyrtidi (Leale et al. 1995; Mizutani 2006), eucolidi (Hedlund et
al. 1996), eulofidi (Hilker et al. 2000), eupelmidi (Powell 1999), pteromalidi (Steidle et
al. 2001, 2003; Mbata 2004), scelionidi (Arakaki et al. 1996, 1997; Colazza et al. 1997,
1999; Borges et al. 1999; Arakaki e Wakamura 2000; Conti et al. 2003; Fiaboe et al.
2003; Silva et al. 2006; Arakaki et al. 2011), trichogrammatidi (Noldus 1988; Frenoy et
al. 1991; Noldus et al. 1991; Frenoy et al. 1992; McGregor e Henderson 1998; Reddy et
al. 2002; Schöller et al. 2002; Fiaboe et al. 2003; Milonas et al. 2009a, b) e braconidi (Hardie et al. 1991; Powell et al. 1993, 1998, 1999; Hedlund et al. 1996; Glinwood et
al. 1999; Reddy et al. 2002; Dweck et al. 2010). Andando più nello specifico gli
esemplari femmina di P. concolor ricercano le larve di tefritidi sulla base di segnali
olfattivi. È stato dimostrato come in una situazione in cui all’animale siano forniti
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non infestati (Benelli et al. 2013c), infatti miscele sintetiche composte dalle sostanze
emesse da pesche e mele attaccate da C. capitata danno luogo ad una forte attrazione
nei confronti di questi insetti. Sia nel caso della pesca che della mela l’effetto attrattivo
è dovuto in buona parte alle sostanze emesse tipicamente dai frutti soltanto se attaccati
da tephritidi (TIFVs – Tephritid Induced Fruit Volatiles): etil octanoato, decanale e 4-
decanolide riguardo la pesca, 1-butil butirrato e 1-butil esanoato per la mela (Benelli et
al. 2013c). Anche i maschi vergini di P. concolor sono attratti da diversi TIFVs della
mela (1-butil butirrato, 1-butil esanoato e 1-esil etil-2-metilbutanoato) e della pesca (etil
octanoato, acido nonanoico, acido decanoico e acido dodecanoico). Alcuni di questi (1-
butil butirrato, 1-butil esanoato e l’acido dodecanoico), inoltre, prolungano il tempo che
il maschio trascorre sulla superficie trattata con il TIFV durante i test. Considerato che
le femmine si accoppiano solo una volta, la percezione dei TIFVs diventa cruciale per i
maschi poiché li guida alla ricerca di frutti infestati dai quali possono sfarfallare delle
femmine, in questo modo i maschi incrementano le loro probabilità di incontrare
femmine recettive; è per questo che i TIFVs sono stati proposti come cairomoni
(Benelli e Canale 2013b). P. concolor può svilupparsi anche su B. oleae che ha, nella
fase di corteggiamento, un peculiare profilo chemio-ecologico. Benché nella maggior
parte dei tefritidi sia la femmina che attrae il maschio, in B. oleae entrambi i sessi
producono feromoni sessuali. Il feromone sessuale prodotto dalle femmine vergini è, in
realtà, un blend di quattro componenti ad azione sinergica: 1,7dioxaspiro[5.5]undecano
(DSU, conosciuto come olean), metil dodecanoato, α-pinene e nonanale (Baker et al.
1980; Mazomenos e Haniotakis 1981, 1985). Tra tutti il DSU è il componente più
abbondante e anche quello che mostra la più alta attività biologica nei confronti dei
maschi (Mazomenos e Haniotakis 1981, 1985). È interessante notare come anche i
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inizio dal primo giorno dopo lo sfarfallamento raggiunge il suo picco quando la
maturazione delle gonadi è completa per poi decrescere fino a zero all’undicesimo
giorno (Canale et al. 2012; Levi-Zada et al. 2012). Una volta raggiunta la maturità
sessuale i maschi di B. oleae iniziano a produrre (Z)-9-tricosene (ZU o muscalure),
sintetizzato solo dal maschio ha lo scopo di attrarre la femmina nella fase del
corteggiamento che si svolge a distanza ravvicinata (Carpita et al. 2012; Canale et al.
2013c). Le femmine di P. concolor vanno alla ricerca delle larve della mosca delle
olive sulla scia di stimoli olfattivi provenienti dalla larva stessa, da ciò che mangia e da
tutti quei metaboliti prodotti dall’interazione larva-substrato (come escrementi o residui
di polpa di oliva masticata) (Canale e Benelli 2012). È comunque possibile che siano in
grado di sfruttare anche i segnali olfattivi rilasciati da esemplari adulti dei loro ospiti,
come è stato notato nel caso di altri parassitoidi larvali (Hedlund et al. 1996; Powell
1999; Reddy et al. 2002). Effettivamente il lek d’accoppiamento di B. oleae si trova
tipicamente sulle piante di olivo (Benelli 2013) e, senza dubbio, intorno a quest’area
possono essere rintracciate molte olive infestate; inoltre non essendo lo ZT molto
volatile quest’area ne rimane pervasa a lungo. Su queste basi si può ipotizzare che i
feromoni sessuali sia maschili che femminili di B. oleae possano essere sfruttatti dalle
femmine di P.concolor come cairomoni di ricerca (Ruther et al. 2002), in modo da
incrementare le chances che ha il parassitoide di localizzare frutti infestati. Inoltre, i
feromoni sessuali di B. oleae potrebbero attrarre anche i maschi di P. concolor in
maniera da aumentare le loro probabilità di trovare femmine recettive, o che stanno
sfarfallando da pupe parassitizzate di B. oleae. Tenendo in considerazione tutto ciò
siamo andati a misurare la risposta comportamentale di esemplari sia maschi che
femmine, vergini e accoppiati, di P. concolor nei confronti dei differenti dosaggi dei
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6.1. Allevamento massale di P. concolor
L'allevamento massale di P. concolor viene, di solito, praticato utilizzando come ospite
di sostituzione la mosca della frutta, C. capitata. L’allevamento dell’Università di Pisa
ha preso il via nel 1990 partendo da un nucleo di femmine di P. concolor ottenute da
olive infestate raccolte in Sicilia. Nei successivi 23 anni il ceppo originario è stato
rinvigorito tre volte con esemplari selvatici nati da olive infestate raccolte in Toscana
(1995 e 1998) e in Calabria (2004). Al fine di ottenere esemplari adulti di P. concolor
un allevamento deve contemplare tre linee di produzione: le larve della C. capitata, gli
adulti della C. capitata e gli adulti di P. concolor.
6.2. Allevamento delle larve di C. capitata
Le larve di C. capitata vengono allevate senza grossi problemi su un substrato
costituito essenzialmente di erba medica macerata. Oltre all’erba medica in pellets la
miscela comprende anche zucchero e lievito che formano la base alimentare, inoltre
vengono aggiunti acido citrico e benzoato di sodio diluiti in acqua al fine di contrastare
l’insediarsi di muffe e batteri. Una volta preparato il composto questo viene lasciato a
riposare per 2-3 giorni. Quando il substrato è pronto viene distribuito in vaschette di
plastica rettangolari (50 x 15 x 2 cm) all’interno delle quali vengono anche “seminate”
le uova di C. capitata raccolte ogni due giorni. Fatto ciò su ogni cassetta viene apposta
la data di semina e poi le vaschette passano in una gabbia a più livelli con fondo
estraibile. Su ciascun livello si troveranno vaschette tutte con la stessa data; queste
verranno scalate verso il basso di un livello ad ogni nuova semina; dopo circa 10 giorni
saranno sul livello più basso della gabbia. Quando le vaschette vengono mosse, oltre a
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l’esposizione alla luce di tutte le larve. Questo sistema risulta molto funzionale poiché
una volta raggiunto l’ultimo stadio di maturazione le larve cadono sul fondo estraibile
della gabbia da dove possono essere facilmente raccolte. In questo modo mi assicuro di
prelevare soltanto larve che abbiano raggiunto un adeguato livello di sviluppo. Le larve
ottenute possono essere sfruttate per la parassitizzazione, e quindi la produzione di P.
concolor, oppure per il mantenimento della linea di C. capitata adulta.
6.3. Allevamento degli adulti di C. capitata
Una percentuale delle larve raccolte viene lasciata impupare e poi raccolta in piccoli
contenitori, ognuno dei quali servirà per la costituzione di una gabbia di adulti di mosca
della frutta. Le gabbie sono ottenute da dei cilindri in PVC del diametro di 30 cm e
lunghi 30 cm. Ciascuna gabbia contiene circa 2000 esemplari adulti (maschi:femmine
1:1). Una delle due estremità è sigillata da una rete metallica, l’altra viene chiusa con
un sacco scuro. All’interno della gabbia viene inserita una vaschetta con un adeguato
numero di pupe, due beverini con acqua ed un contenitore con il nutrimento. Il
nutrimento artificiale per gli adulti della mosca mediterranea della frutta avviene
mediante la somministrazione di una dieta secca composta da zucchero a velo ed
estratto di lievito in rapporto 10:1. In condizioni sperimentali è stato notato che
aumentando leggermente la dose dell’estratto di lievito si assiste ad un aumento del
numero di uova prodotte. Una volta che tutti gli elementi sono stati posti all’interno
della gabbia viene chiuso anche il sacco all’estremità e la gabbia è posta su un idoneo
supporto in maniera che venga illuminato il lato chiuso con la rete. Sfruttando
l’attrazione di questi insetti verso la luce si fa in modo che le femmine ovidepongano
proprio sulla rete metallica così che le uova fuoriescano e cadano in apposite canaline
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6.4. Allevamento di P. concolor
Parte delle larve raccolte viene posta all’interno di sacchetti chiamati manicotti,
all’interno di ogni manicotto sono raccolte qualcosa come 600-800 larve di C. capitata
al terzo stadio. Le larve che finiscono all’interno dei manicotti sono quelle destinate
alla parassitizzazione. Ogni manicotto, infatti, viene fissato ad un supporto e inserito in
una gabbia contenente adulti di P. concolor. Giunto all’interno della gabbia il
manicotto viene aggredito dalle femmine del parassitoide che ovideporranno nelle
larve. Importante prestare attenzione sia all’inserimento che all’estrazione del
manicotto poiché in questi momenti la gabbia rimane aperta e, dunque, esposta alla
fuga degli insetti. Al fine di evitare fenomeni di superparassitismo, che impedirebbero
un corretto sviluppo della larva di P. concolor, deve essere ben ponderato il tempo di
permanenza del manicotto nella gabbia. Questo si valuta sulla base del numero di
femmine presenti nella gabbia stessa, di solito un tempo di 15-20 minuti risulta ideale.
A questo punto, a seconda di quanti esemplari desideriamo per la nuova gabbia, si
riuniscono le larve parassitizzate di più manicotti e le si dispongono in sacchi di rete
chiusi. Tale passaggio è reso necessario dal fatto che non tutte le larve saranno state
parassitizzate e, dunque, dalle pupe sfarfallerà anche qualche esemplare di C. capitata.
Grazie all’assenza di nutrimento e sfruttando i diversi tempi di sviluppo delle forme
giovanili di queste due specie si riesce a far si che all’interno dei sacchi gli esemplari di
mosca della frutta sfarfallino e muoiano prima che sfarfalli il primo esemplare di P.
concolor. Quando nel sacco tutte le mosche saranno morte è possibile mettere le
rimanenti pupe all’interno della gabbia con acqua e del nutrimento costituito da una
miscela di miele e polline. La gabbia per P. concolor ha dimensioni leggermente
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lunghezza, sono in Plexiglas e quindi trasparenti. Ogni gabbia contiene al suo interno
1500 adulti (maschi:femmine 3:5). Anche in questo caso le due estremità sono chiuse
da una parte con della rete e dall’altra con un sacco scuro, in più questo tipo di gabbia
(se da allevamento e non da lancio) ha un foro per permettere l’immissione del
manicotto. Le gabbie di P. concolor utilizzate per l’allevamento sono mantenute fino a
quando ci sia al suo interno un numero sufficiente di femmine, se in una gabbia ce ne
sono troppo poche vengono prelevate e poste in una gabbia più ricca e giovane.
6.5. Biosaggi comportamentali
I parassitoidi, dal momento dello sfarfallamento vengono separati in base al sesso e poi
mantenuti individualmente in provette e alimentati con una dieta semisolida costituita
da miele e polline, somministrata tramite tamponcini di cotone. Anche i parametri
ambientali sono controllati in modo che la temperatura sia 21 ± 1°C, l’umidità relativa
50 ± 5% e il fotoperiodo 16:8 (luce:buio). L’attrattività dei feromoni sessuali di B.
oleae, DSU e ZT, è stata testata su esemplari di P. concolor sia maschi che femmine,
vergini e accoppiati. Per ottenere gli esemplari accoppiati singole coppie di P. concolor
sono state osservate fino all’avvenuto accoppiamento. Per ciascuno dei due composti
sono stati effettuati test a tre diversi dosaggi: 1, 5 e 10 mosche equivalenti (ovviamente,
femmine equivalenti per il DSU, maschi equivalenti per lo ZT). Da studi precedenti
sappiamo che 1, 5 e 10 femmine equivalenti corrispondono rispettivamente a 300 ng,
1500 ng e 3000 ng di DSU. 1, 5 e 10 maschi equivalenti corrispondono rispettivamente
a 0.62 µg, 3.1 µ g e 6.2 µ g di ZT (Canale et al. 2013c). Riguardo al reperimento dei due
composti il DSU è stato acquistato dalla Sigma Aldrich, lo ZT è stato sintetizzato
secondo la procedura di Fisher e Tyman (1998) (chimicamente e stereoisomericamente
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scelte sono stati condotti utilizzando un’arena in Plexiglaschiusa delle dimensioni di 15