KREBS VON DEN LUNGEN-6 (KL-6)

La molecola: caratteristiche e significato clinico.

Krebs von den Lungen-6 (KL-6) è una glicoproteina ad elevato peso molecolare, codificata da gene MUC1, espressa soprattutto sulla superficie delle cellule epiteliali alveolari di II tipo. E' secreta dagli pneumocitici alveolari di tipo e dalle cellule epiteliali bronchiali in risposta ad una danno cellulare e alla rigenerazione nei pazienti con ILD (160). Infatti, durante tali processi, infiammatori e non, a livello dell'interstizio e delle vie respiratorie, le cellule epiteliali alveolari di tipo II proliferano portando ad una iperplasia di tali cellule. Le cellule epiteliali alveolari di tipo II secernono molte citochine e proteine coinvolte nella risposta infiammatoria locale, tra cui KL-6 che rappresenta il trigger per il segnale TGF-β e quindi per la fibrosi (161). KL-6 oltre a questo noto effetto pro fibrotico ha anche effetto anti apoptotico sui fibroblasti polmonari. E’ stato ipotizzato che KL-6 sia liberato vicino alla superficie della membrana delle cellule epiteliali alveolari di tipo II danneggiate, e questa quota solubile di KL-6 si distribuisce nel liquido intorno al polmone e nel flusso sanguigno dove può essere misurata (163-165). I livelli sierici di KL-6 sono stati riportati elevati in numerose malattie interstiziali polmonari tra cui la fibrosi idiopatica polmonare, la polmonite interstiziale associata a malattie vascolari del collagene e altre malattie polmonari caratterizzate da interstiziopatia (162-166). Per tale motivo tale molecola è da considerarsi un importante marker di fibrosi polmonare accurato, sensibile e specifico (167), sia come marcatore diagnostico (168,169) sia come marker di attività di malattia polmonare (164,165) sia come monitoraggio dell'efficacia della terapia.

KL-6 come marker diagnostico di presenza di ILD

La letteratura degli ultimi decenni conferma l'associazione tra i livelli di KL-6 e la presenza di ILD. Recentemente è stato condotto uno studio multicentrico

43 coinvolgente 1084 pazienti affetti da ILD (159). Tale studio ha documentato livelli sierici di KL-6 significativamente aumentati in pazienti affetti da ILD rispetto a individui sani ma anche rispetto a pazienti con malattia polmonare non ILD (TBC, polmoniti, bronchiettasie, BPCO). La sensibilità diagnostica di KL-6 è stata calcolata a 77,75% e la specificità a 94,5%. Questi risultati sono in linea con quelli riportati precedentemente da Fathi at al. (170) che ha dimostrato l'associazione tra livelli di KL-6 e ILD in popolazione caucasica di pazienti affetti da PM/DM, con quelli di Ohshimo et al (171) sulla fibrosi cistica e con quelli di Vesel et al sulla SSc (172).

KL-6 come marker prognostico di malattia

Molti studi hanno documentato che i livelli sierici di KL-6 correlano positivamente con il grado di severità di malattia polmonare. Honda et al (173) hanno comparato i livelli sierici di KL-6 tra pazienti con diversi gradi di severità alla radiografia del torace. I risultati hanno dimostrato che pazienti con ILD definita severa alla radiografia del torace, avevano livelli sierici di KL-6 più alti. Kinoshita et al (174) hanno invece comparato i livelli sierici di KL-6 tra pazienti con ILD secondaria ad AR con diverso score totale alla HRTC del torace. I risultati hanno dimostrato che i pazienti che presentavano score maggiore alla HRTC avevano anche livelli più alti di KL-6.

Oshimo et al (175) hanno dimostrato livelli aumentati di KL-6 al baseline in pazienti con ILD che successivamente avevano sviluppato una riacutizzazione della malattia polmonare; i pazienti che invece la baseline avevano livelli sierici più bassi di KL-6 non erano andati incontro a riacutizzazione.

KL-6 come marker di risposta alla terapia

Dato il dimostrato valore di KL-6 come marker di presenza e di gravità di malattia interstiziale polmonare, è stato proposto di utilizzarlo anche per valutare la risposta alla terapia. Recentemente Hu et al (159) hanno dimostrato che i pazienti affetti da ILD che avevano mostrato un miglioramento della ILD dopo la terapia, presentavano livelli sierici post terapia molto più bassi rispetto al valore basale. Anche i pazienti che erano rimasti stabili dopo la terapia mostravano livelli ridotti rispetto al baseline ma solo lievemente. Nei pazienti che invece avevano avuto una ricaduta i livelli sierici di KL-6 post trattamento erano più alti rispetto al baseline. In particolare la riduzione dei livelli di KL-6 post trattamento si osservava nei

44 pazienti con ILD associata a connettiviti, sia in caso di miglioramento della ILD sia in caso di stabilità del quadro. In questo studio è stato inoltre quantificata la differenza tra i valori sierici di KL-6 pre e post trattamento ed è stato dimostrato che nei pazienti che miglioravano dopo terapia la riduzione del K-6 era > del 20% del livello sierico pre trattamento; nei pazienti che andavano incontro a riacutizzazione l'entità dell'aumento di KL-6 era > del 20% del livello sierico pre trattamento. Kumanovics et al (176) che hanno valutato pazienti affetti da ILD secondaria a SSc e PM/DM dimostrando che KL-6 non si associava alla gravità della fibrosi e che dopo la terapia con ciclofosfamide i livelli sierici di KL-6 erano più bassi ma in assenza di un miglioramento della funzione polmonare.

Cut Off: valori di riferimento

Molti degli studi che hanno valutato il ruolo di KL-6 nella valutazione di ILD sono stati condotti su popolazioni giapponesi o paesi orientali. Va sottolineato che i valori di KL-6 possono variare a seconda delle popolazioni. Sono stati inoltre riportate differenze etniche nello sviluppo e nella progressione della ILD (177). Tra le differenze riportate, il background genetico è tra i più importanti. Gli Studi condotti sul polimorfismo del gene MUC1 hanno infatti dimostrato che il genotipo del gene varia nelle diverse etnie risultando in valori sierici basali di KL-6 diversi e quindi il cut-off di riferimento per le diverse etnie potrebbe essere diverso (168, 178,179). In Giappone il cut-off sierico dei livelli di KL-6 è di 500 U/mL ed è usato nella pratica clinica per distinguere pazienti sani da quelli con ILD e pazienti con malattia polmonare non-ILD da quelli con ILD (168). Doishita et al (165) hanno valutato i valori di riferimento di KL-6 in corso di ILD associata a malattia del connettivo concludendo che livelli sierici di KL-6 >500 U/mL sono diagnostici per la presenza di ILD e valori > 1000 U/mL sono invece diagnostici di ILD attiva. Hu et al (159) recentemente hanno usato un cut -off di KL-6 di 500U/mL mostrando elevata sensibilià e specificità (77,7% e 94,5% rispettivamente). Fathi et al (169) hanno valutato un cut-off di 549 U/mL mostrando una sensibilità dell'83% e specificità del 100% di KL-6 nel diagnosticare ILD in corso di PM /DM in popolazione caucasica. I maggiori studi su KL-6 sono stati eseguiti da gruppi giapponesi, su popolazioni giapponesi.

45 KL-6 nelle malattie del connettivo: ruolo diagnostico e prognostico

La letteratura degli ultimi anni ha dimostrato la correlazione tra livelli sierici di KL- 6 e ILD secondaria a connettivite. Come per ILD da altra eziologia, anche nelle ILD secondarie a connettivi KL-6 può esser e considerato un marker diagnostico di ILD, ma correla anche con la severità di malattia alle PFR e alla TC correlando direttamente con gli score della TC ed inversamente con i valori di FVC e DLCO. Nakajima et al (180) hanno studiato un gruppo di pazienti con connetivite (tra cui SSc, AR, PM/DM) dimostrando che i sotto gruppi di pazienti con ILD secondaria a connettivite mostravano un aumento dei livelli sierici di KL-6. Il KL-6 ha mostrato una sensibità del 60% circa, specificità per ILD del 98% con valore predittivo positivo del 98.9 %. Inoltre i livelli di KL -6 correlavano con attività di malattia e con la risposta alla terapia. Yamane et al (181) e Yanaba et al (164) hanno studiato corti di soli pazienti sclerodermici con fibrosi polmonare. I risultati ottenuti sono in linea con la letteratura a riguardo. Nel primo studio 91 pazienti sclerodermici hanno mostrato valori sierici di KL-6 aumentati rispetto al gruppo dei controlli, i valori erano elevati soprattutto nella forma diffusa rispetto alla limitata e soprattutto nei pazienti con ILD associata. Inoltre i livelli correlavano in modo inversamente proporzionali con i valori di DLCO e FVC. Nel secondo studio inoltre si dimostrava che un rapido aumento dei livelli circolanti di KL-6 era associato p ad una ILD di nuova insorgenza o ad una esacerbazione della ILD. Kumanovics et al. (174) hanno studiato KL-6 nei pazienti con Sclerosi sistemica (SSc) e con miopatie infiammatorie (PM/DM). I risultati dello studio hanno dimostrato non solo che i livelli di KL-6 erano aumentati nei pazienti con Ssc e PM/DM, ma che KL-6 aumentava soprattutto nei pazienti che avevano anche ILD documentata radiologicamente. Tale correlazione aumentava in presenza di ILD non solo radiologica ma anche documentata alle PFR. A tale riguardo in questo studio i livelli di KL-6 sono stati correlati sia con le PFR sia con i vari pattern descrittivi evidenziati alla HRTC del torace. I livelli di KL-6 sono inversamente proporzionali ai valori della DLCO ed, essendo la riduzione della DLCO un marker precoce di fibrosi polmonare, KL-6 potrebbe essere considerato un marker precoce di coinvolgimento fibrotico polmonare. Riguardo ai quadri radiologici rilevati alla HRTC del torace KL-6 è aumentato nei pazienti che mostravano un quadro GGO alla HRTC, ma i livelli sierici erano ancora più alti i quei pazienti che presentavano honey combing (con livelli di significatività maggiore rispetto al GGO). Questa

46 ultima correlazione, essendo honey combing un quadro più severo di ILD, suggerisce che KL-6 sia espressione di un quadro di danno polmonare piuttosto che di attività di malattia (174,175). Recentemente Hesselstrand et al (182) hanno analizzato le chemochine dal BAL di pazienti sclerodermici con ILD, in questi pazienti il liquido del BAL conteneva una concentrazione maggiore di KL-6 rispetto ai controlli sani e che i livelli di KL-6 erano correlati con la percentuale di eosinofili. Gli autori hanno anche documentato una correlazione con i pattern della HRTC. I pazienti che mostravano livelli più alti di KL-6 avevano alla HRTC dei quadri di GGO . Questo conferma che KL-6 possa essere considerato un marker di attività di ILD. Lo scorso anno Oguz et al. (183) hanno confermato l'aumento sierico di KL-6 in una popolazione di pazienti con ILD secondaria a malattie del connettivo (n=68) (comprendente 33% SS). Il livello medio di KL-6 rilevato nel siero dei pazienti con con ILD secondaria a MCTD sono pari a 33U/microL, nel siero dei pazienti con MCTD senza ILD 3,9U/microL e nei controlli sani 3,6 U/microL. Lo studio ha inoltre segnalato che non vi erano differenze tra le sottopopolazioni considerate (LES; AR; SS; DM/PM; SSc; MCTD) ma che anche nel gruppo dei controlli sani i fumatori mostrano livelli aumentati di KL-6 (182).

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2.

CATELICIDINA (LL-37)

La molecola: caratteristiche e significato clinico.

La catelicidina (LL-37) è una molecola appartenente alla famiglia dei peptidi antimicrobici (AMPs). Questo insieme di peptidi, comprendente anche le difensine, hanno un ruolo determinante nella risposta immunitaria innata contro l'invasione negli epiteli (inclusa la cute, il sistema respiratorio e quello gastroenterico) da parte di patogeni. LL-37 è l'unica AMP prodotta nell'uomo (184). Questa molecola è espressa da molti tipi cellulari compreso le cellule mieloidi, cellule epiteliali gastrointestinali e delle vie respiratorie, macrofagi, linfociti, neutrofili e cellule endoteliali (185-187). Negli ultimi decenni questa molecola è stata molto studiata e si è dimostrato che non ha solo una funzione di difesa contro i patogeni con effetto antimicrobico diretto e di attivazione del sistema immunitario, ma presenta anche un ruolo importante nell'angiogenesi, nell'infiammazione, nella regolazione dell'apoptosi, nella guarigione delle ferite e nel rimodellamento dei tessuti (188,189). In particolare, riguardo all'attività antimicrobica LL-37 distrugge i patogeni sia G+ che G- grazie ad una attività citotossica diretta, a processi di tossicità rivolti contro LPS e ad una promozione dell'apoptosi. L'effetto pleiotropico della molecola riguarda il suo potere nella stimolazione della angiogenesi e della fibrosi, nella promozione della crescita cellulare e dell'angiogenesi durante la guarigione delle ferite, la regolazione dell'apoptosi e la regolazione della flogosi attraverso il rilascio di citochine e chemochine tra cui IL-8 (190). Le funzioni immunomodulatorie ed immunomodulanti di LL37 sono mediate dall’interazione con il recettore P2X7 che porta al rilascio di IL- 1b e di IL-8 (191). Per le enormi proprietà immunomodulanti LL-37 stata studiata in molte malattie autoimmunitarie tra cui AR, SSc, LES, psoriasi. Nessuno studio fino ad oggi ha valutato il ruolo della molecola in altre connettiviti o nella SS.

Ruolo di LL-37 nella fibrosi polmonare

Sono stati dimostrati elevati livelli di LL-37 nelle malattie polmonari infiammatorie ed infettive. Elevati livelli di LL-37, infatti, sono stati trovati elevati nella fibrosi cistica e nella BPCO, sono invece stati segnalati bassi livelli di LL-37 nell'asma (192-195). Il ruolo di LL-37 nella fibrosi polmonare rimane però controverso. E' stato dimostrato che l'iniezione intratracheale di LL-37 inibisce la secrezione di

48 TNFalfa da parte dei macrofagi alveolari (196). LL 37 promuove la migrazione epiteliale e la proliferazione (197) e contribuisce alla ridotta angiogenesi e alla proliferazione cellulare epiteliale nel polmone. Alte concentrazioni di LL-37 possono indurre l'apoptosi nelle cellule epiteliali delle vie aeree sia in vitro che in vivo (198).

A livello delle cellule epiteliali delle vie aeree è stato dimostrato che LL-37 rappresenta un fattore importante per il mantenimento dell'omeostasi e dell'integrità del tratto respiratorio. LL-37 è capace infatti di indurre la guarigione delle lesioni, induce la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali delle vie aeree; questi effetti sono mediati dal coinvolgimento di EGFR, GPCR e MAPK. Inoltre la difesa dai patogeni esterni è espressa tramite azione antimicrobica e si associa alla modulazione della funzione del sistema immunitario (199).

Ruolo di LL-37 nella Sclerosi sistemica

Una volta che dalla letteratura sono emerse le proprietà proangiogenetiche, di riparazione tissutale, di regolazione dell'apoptosi cellulare ed immunomodulanti di LL37, la molecola è stata indagata anche nella SSc. La molecola è iper espressa nei fibroblasti dermici (200-204). LL-37 nella SSc può regolare la produzione di collagene, l'infiammazione, la funzione immunitaria e l'apoptosi. Recenti studi hanno dato risultati contrastanti riguardo l'associazione di LL-37 con la fibrosi. Nonostante le proprietà antifibrotiche di LL-37 documentate nei cheloidi umani, l'espressione del peptide appare aumentato nei fibroblasti del derma dei pazienti sclerodermici dove promuoverebbe la fibrosi attraverso l'inibizione della apoptosi cellulare (205,206).

Hee at al (207) hanno dimostrato che LL-37 è implicato nella sclerosi cutanea dei pazienti sclerodermici in quanto ne inibisce l'apoptosi. L'espressione di catelecidina è risultata aumentata nella cute dei pazienti sclerodermici. In questo studio sono stati inoltre descritti i meccanismi tramite cui LL-37 inibisce l'apoptosi. LL-37 aumenta l'espressione di Bcl 2, di caspasi 3 e riduce quella di Bax sbilanciando così il sistema Bcl2 /Bax in senso antifibrotico. LL-37 inoltre aumenta l'espressione di COX 2 e la produzione di PGE 2 andando quindi a stimolare due sistemi di protezione contro l'apoptosi e inibendo quindi l'apoptosi dei fibroblasti. Inoltre LL- 37 inibisce l'apoptosi anche attraverso il coinvolgimento di ERK. Takahashi et al (208) hanno valutato l'espressione di LL-37 in siero e biopsie di pazienti

49 sclerodermici e in modelli murini di SSc. L'espressione di LL-37 è aumentata nei fibroblasti dermici, nelle cellule dell'infiltrato infiammatorio perivascolare, nei cheratinociti e nei piccoli vasi dermici dei pazienti con SSc. Tale risultato è confermato anche dall'analisi del micro RNA nella cute. Anche CRAMP, analogo di LL-37 nel modello murino, è risultato aumentato nei fibroblasti dermici, nei piccoli vasi, nell'infiltrato infiammatorio perivascolare e nei cheratinociti dei topi SSc. Considerando i livelli sierici di LL-37, appaiono aumentati nei pazienti sclerodermici rispetto ai controlli sani e nei pazienti con forma diffusa di malattia rispetto a quelli con forma limitata di malattia. Le correlazioni cliniche dei livelli di LL-37 hanno mostrato una correlazione con il mRSS, con la presenza di fibrosi esofagea e polmonare (ILD). Per quanto riguarda la funzione polmonare LL-37 correla con ILD, con la presenza di GGO ma correla inversamente con i valori della FVC e della DLCO. Per quanto riguarda l'interessamento vascolare livelli aumentati di LL-37 si associano alla presenza di ulcere digitali ma non con il pattern capillaroscopico né con l'ipertensione polmonare. Risultati contrastanti sono invece quelli provenienti dallo studio di Hizal et al (209.) che hanno descritto bassi livelli di LL-37 nei pazienti sclerodermici con ILD associata. I livelli di LL-37 non sono apparsi comunque correlati né con la funzionalità respiratoria alle PFR, né con i diversi pattern della HRTC del torace. Dati recenti suggeriscono che la down regolazione di LL-37 sia coinvolta nella patogenesi della SSc, e della ILD- secondaria a SSc. Lo stimolo inibitorio dell'INF gamma sulla proliferazione dei fibroblasti e sulla sintesi del collagene è marcatamente ridotto nei pazienti con SSc. Recentemente uno studio ha mostrato livelli di IFN gamma aumentati in pazienti con SSc clinicamente stabili rispetto ai controlli sani, questo è dovuto ad una iperproduzione dell'INF gamma da parte dei linfociti sclerodermici. Basandoci sul ruolo di IFN gamma nella patogenesi della ILD- associata a SSc, la spinta down regolatrice dell'INF gamma su LL-37 potrebbe spiegare i bassi livelli di LL-37 nei pazienti con ILD-secondaria a SSc (210).

Nei pazienti sclerodermici IL-6 è associata all'attività e alla severità di malattia, considerando l'effetto di down regolazione di IL-6 nei confronti dell'espressione di LL-37, IL-6 potrebbe essere responsabile dei bassi livelli di LL-37 nei pazienti sclerodermici con coinvolgimento polmonare.

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3. INTERLEUCHINA 8 (IL-8)

La molecola: caratteristiche e significato clinico.

Interleuchina 8 (IL-8 o CXCL8) è un polipeptide di 72 aminoacidi che rappresenta uno dei più importanti mediatori della risposta flogistica; funziona da citochina chemotattica che recluta le cellule infiammatorie, principalmente neutrofili e, attivandole, le dirige nel sito di infiammazione (211). IL-8 è prodotta sia da cellule immunitarie che non, in riposta a stimoli appropriati esogeni ed endogeni. La presenza di IL-8 è stata dimostrata in numerose malattie infiammatorie caratterizzate da infiltrazione neutrofila come la psoriasi (212), l’artrite reumatoide (213,214) e anche la sepsi (215). In corso di SSc IL-8 è chiaramente responsabile dello sviluppo del danno fibrotico sia a livello cutaneo che polmonare. Le biopsie cutanee di pazienti affetti da SSc mostrano livelli aumentati di IL-8 (216) ed in cultura i fibroblasti del derma di pazienti sclerodermici producono livelli maggiori di IL-8 rispetto ai fibroblasti normali (217).

Ruolo di IL-8 nelle interstiziopatie polmonari

Una delle fonti maggiori di IL-8 è rappresentata dai macrofagi alveolari, queste cellule producono anche TNFα e IL-1 che per attività paracrina, inducono altre cellule non immuni ad esprimere IL-8 (218,219). E’ stato dimostrato che molte altre cellule hanno la capacità di produrre IL-8 come ad esempio le cellule che costituiscono la membrana alveolo-capillare, cellule endoteliali ed i fibroblasti. La produzione di IL-8 ha come effetto principale il reclutamento dei neutrofili nell’interstizio polmonare e negli spazi aerei polmonari (220). L ’accumulo sostanzioso di neutrofili nello spazio alveolare, responsabile dell’alveolite neutrofila è la causa principale del danno polmonare e della successiva fibrosi polmonare (221). In vitro la stimolazione dei neutrofili da parte di IL-8 determina molte risposte tra cui l’adesione all’endotelio, la degranulazione neutrofila, la secrezione di enzimi, il rilascio di radicali liberi dell’ossigeno e quindi l’induzione del danno alveolare e la up-regolazione dei meccanismi di riparazione. Tutto ciò porta al danno fibrotico polmonare mediante un meccanismo di fibrosi ma anche di angiogenesi (222-224).

51 Ulteriore evidenza del coinvolgimento dell’IL-8 nel danno polmonare deriva dall’uso di anticorpi neutralizzanti IL-8 che hanno avuto come risultato la riduzione del danno polmonare e dei livelli di cellule polimorfonucleate reclutate a livello polmonare (225). La correlazione tra IL-8 e interstiziopatia polmonare è stata dimostrata in molti studi; nelle biopsie di polmone affetto fa fibrosi polmonare idiopatica è stata documentata elevata espressione di IL-8, derivata soprattutto dai fibroblasti polmonari (226). Livelli sierici elevati di IL-8 e di mRNA sono stati dimostrati nel BAL dei pazienti con ILD idiopatica e tali livelli correlavano con la percentuale dei polimorfonucleati presenti nel BAL (227).

Livelli aumentati di IL-8 sono stati descritti in corso d interstiziopatia secondaria a connettiviti sistemiche.

Al- Mutairi et al. (228) hanno riportato che i pazienti con LES complicato da coinvolgimento polmonare avevano livelli di citochine sieriche più alte di quelli senza coinvolgimento polmonare, in particolare IL-8, TNFα e INFγ. Lit et al. (229) hanno documentato una correlazione positiva dei livelli di IL-8 con l’attività di malattia valutata tramite SLEDAI e questi risultati sono stati confermati anche da Nielepkowicz-Gozdzinska et al. (230)

IL-8 è implicata nella patogenesi della interstiziopatia polmonare anche in corso di SSc: è noto infatti che i macrofagi alveolari dei pazienti sclerodermici producono elevate quantità di IL-8 (231,232) che è responsabile dal richiamo e dell’attivazione