SCOPO E DISEGNO DELLO STUDIO

Questo studio prevede la valutazione di 5 molecole che potrebbero essere coinvolte in diversi momenti patogenetici della ILD secondaria a pSS: KL-6, LL-37, IL-8, MCP-1 e RANTES.

Lo scopo primario dello studio è quello di identificare il ruolo delle molecole proposte come marcatori di ILD in corso di pSS. In particolare verranno analizzati e messi a confronto i livelli sierici delle molecole di interesse in pazienti con/senza ILD secondaria a pSS, in pazienti SSc con/senza ILD e in soggetti sani.

6.

MATERIALI E METODI

Pazienti

Sono stati arruolati nello studio 26 pazienti affetti da pSS provenienti dagli ambulatori reumatologici della SOD di reumatologia dell’università degli studi di Pisa, di cui 9 con un interessamento polmonare interstiziale significativo alla valutazione HRTC del torace. Il gruppo di controllo è costituito da 32 individui sani e 30 pazienti sclerodermici classificati secondo i criteri, di cui 11 con significativa ILD all’esame HRTC del torace, provenienti dagli ambulatori reumatologici della SOD Reumatologia dell’università degli Studi di Firenze.

Ogni paziente con pSS diagnosticato secondo i criteri AECG (52) è stato indagato mediante esami immunologici, biopsia delle ghiandole salivari minori, visita oculistica con test per occhio secco, ecografia delle ghiandole salivari minori. La valutazione polmonare è stata eseguita in pazienti sintomatici per dispnea o tosse o sintomatologia respiratoria mediante esecuzione di PFR con DLCO, HRTC del torace in caso di riduzione significativa del DLCO (<80%) o della FVC (<80%). I pazienti affetti da SSc, definiti secondo i criteri ACR/EULAR 2013 (279), sono stati indagati dal punto di vista respiratorio con le stesse metodiche. Il gruppo di

58 controllo negativo è costituito da soggetti sani che volontariamente hanno acconsentito al prelievo.

Le caratteristiche anagrafiche dei pazienti e dei controlli analizzati sono riportate in Tabella 1.

Tabella 1. Caratteristiche demografiche

pazienti n età sesso

pSS -non ILD 17 55,2 F=16 M=1 pSS -ILD 9 67,4 F= 7 M=2 SSc-non ILD 19 67,4 F= 16 M=3 SSc-ILD 11 59,4 F= 8 M=3 Controlli sani 32 43,3 F= 32 Metodi

Raccolta dei sieri

Il sangue fresco venoso è stato prelevato dai pazienti con SSc e da controlli sani, lasciato a temperatura ambiente per 30 minuti e successivamente centrifugato a 1,500 g per 15 minuti. Il siero è stato raccolto e conservato in aliquote a -80°C fino all’uso. I pazienti con pSS sono stati sottoposti ad un prelievo di 4 ml di sangue venoso periferico. Dopo separazione mediante centrifugazione a 2000 rpm per 10 minuti, il siero ottenuto è stato congelato a -20 °C fino all’uso. Ogni paziente ha sottoscritto il consenso informato.

Dosaggio immunoenzimatico su siero di KL-6 e LL-37

I livelli sierici di LL-37 e KL-6 sono stati misurati tramite test Elisa colorimetrico commerciale (numero di catalogo LS-F20736, LifeSpan BioSciences Inc per LL37 e numero di catalogo MBS026021, MyBioSource per KL-6) seguendo le istruzioni del produttore. Ciascun campione è stato misurato in duplicato. Il detection range del saggio Elisa per LL-37 è pari a 1,56-100 ng/ml mentre quello per KL-6 è di 62,5-2000 U/ml.

Dosaggio RANTES, IL-8, MCP-1

Il dosaggio delle chemochine è stato eseguito mediante analisi quantitativa “sandwich ELISA” (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), utilizzando kit Duo- Set prodotti dall’R&D system (catalog number: MCP-1 DY279, IL-8 DY208, RANTES DY 278).

59 Analisi statistica

L’analisi statistica per i dati riguardanti KL-6 e LL-37 è stata effettuata utilizzando il software SPSS per Windows Versione 20.0 (SPSS). Le statistiche descrittive sono state espresse come mediana, interquartile range (IQR), valore minimo e massimo. I livelli circolanti di LL-37 e KL-6 sono stati analizzati con il test non parametrico per campioni indipendenti Mann-Whitney U test.

I dati relativi ai dosaggi di RANTES/CCL5, IL-8/CXCL8, MCP-1/CCL2 sono espressi come media + deviazione standard di ogni campione valutato in duplicato. Per lo studio statistico è stato utilizzato il Software GraphPad ed il programma GraphPad Prism 5 per l’analisi dei dati. I dati dei 2 gruppi (patologici e normali) sono stati analizzati mediante il test non parametrico di Mann-Whitney. La probabilità inferiore a 0.05 è stata considerata statisticamente significativa.

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7. RISULTATI

Caratteristiche cliniche dei pazienti

Un totale di 56 pazienti provenienti dalle due strutture cliniche-universitarie di Pisa e Firenze sono stati arruolati nello studio.

I pazienti affetti da pSS provenienti dagli ambulatori reumatologici della SOD di reumatologia dell’università degli studi di Pisa sono un totale di 26. Di questi pazienti, 9 avevano un interessamento polmonare interstiziale significativo alla valutazione HRTC del torace. Il gruppo di controllo è costituito da 32 individui sani e 30 pazienti sclerodermici provenienti dagli ambulatori reumatologici della SOD Reumatologia dell’università degli Studi di Firenze. Dei 30 pazienti sclerodermici, 11 mostravano una significativa ILD all’esame HRTC del torace.

Le caratteristiche cliniche della popolazione affetta da SS sono riassunte nella Tabella 2.

Tabella 2. Caratteristiche cliniche della popolazione SS.

SS TOT (N=26) SS +ILD (N=9) SS- ILD (N=17) DURATA DI MALATTIA 7 9,2 5,8 ANA (25/26) 96,1% (8/9) 88,9% (17/17) 100% SSA (21/26) 80,8% (5/9) 55,5% (16/17) 94,1% SSB (9/26) 34,6% (3/9) 33,3% (6/17) 35,3% FR (15/26) 57,6% (7/9) 77,8% (8/17) 47 % IPERGAMMAGLOBULINEMIA (18/26) 69,2% (5/9) 55,5% (13/17) 76,5% TUMEFAZIONE GHIANDOLE SALIVARI (5/26) 19,2% (0/9) 0% (5/17) 29,4 % LINFOADENOPATIE (9/26) 34,6% (2/9) 22,2% (7/17) 41,1% IPOCOMPLEMENTEMIA (4/26) 15,4% (2/9) 22,2% (3/17) 17,6%

61 Livelli sierici di KL-6

I livelli sierici di KL-6 sono risultati significativamente più elevati nei pazienti pSS in totale (mediana 536,71 U/ml; IQR 394,93-1105,9 U/ml) rispetto ai controlli sani (mediana 376,04 U/ml; IQR 195,99-525,63 U/ml) (p=0.012). I pazienti Sjögren con ILD hanno valori di KL-6 maggiori rispetto ai pazienti Sjögren senza ILD anche se la differenza non raggiunge la significatività (mediana 897.58 U/ml; IQR 434,43- 1335,64 U/ml in pazienti Sjögren con ILD; mediana 479,52 U/ml; IQR 273,42- 1040,96 U/ml in pazienti Sjögren senza ILD). Pazienti Sjögren con ILD hanno mostrato valori di KL-6 significativamente maggiori rispetto ai controlli (p=0,007). Non è emersa alcuna differenza significativa tra i valori di KL-6 nei pazienti SSc in totale (mediana 363,03 U/ml; IQR 155,54-548,9 U/ml) o suddivisi in SSc con o senza ILD (mediana 337.87 U/ml; IQR 129.91-458.67 U/ml e mediana 388,2 U/ml; IQR 164,1-669,72 U7ml, rispettivamente) rispetto ai controlli sani.

Inoltre, KL-6 è risultato più elevato nei pazienti pSS rispetto agli SSc (p=0,009) ed in particolare in pazienti pSS con ILD verso pazienti SSc con ILD (p=0,01).

I risultati ottenuti sono riassunti in tabella 3 e rappresentati nel grafico 1. Tabella 3. Livelli sierici di KL-6 nelle popolazioni studiate.

pazienti Mediana

(U/ml)

IQR min -max (U/ml)

Sjögren totali (n=26) 536,71 394,93-1105,9 117,08- 1719,35 Sjögren senza ILD

(n=17)

479,52 273,42-1040,96 117,08- 1719,35

Sjögren con ILD (n=9) 897,58 434,43-1335,64 174,24- 1634,16 SSc totali (n=30) 363,03 155,54-548,9 56,06- 2508,32 SSc con ILD (n=11) 337,87 129,91-458,67 73,03- 1036,24 SSc senza ILD (n=19) 388,2 164,1-669,72 56,06- 2508,32 Controlli sani (n=32) 337,87 164,1-669,72 37,6- 3169,45

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