Rappresentazione tramite box plot dei livelli sierici di LL-37 misurati con test

Elisa colorimetrico. (A) livelli sierici di LL-37 nei pazienti Sjögren, SSc e controlli sani. (B) livelli sierici di LL-37 nei pazienti Sjögren con/senza ILD, SSc con/senza ILD e controlli sani. Ciascuna scatola rappresenta il 25°e 75° percentile. Le linee al di fuori della scatola rappresentano il 10° e 90° percentile. Le linee all’interno della scatola rappresentano la mediana e i cerchi i valori estremi.

65 Dosaggio sierico di IL-8/CXCL-8

Non è emersa alcuna differenza significativa tra i livelli sierici di IL-8 in pazienti con SS con ILD rispetto ai pazienti senza ILD. Inoltre da notare che i livelli di IL-8 nel gruppo di controllo mostrano valori più alti rispetto ai pazienti con SS (79,18 pg/ml vs 22,60 pg/ml), pur non raggiungendo la significatività statistica. I dati sono riassunti nella tabella 5 e rappresentati nel grafico 3.

Tabella 5. Livelli sierici di IL-8/CXCL-8 nelle popolazioni studiate.

Pazienti Mediana (pg/ml)

Sjögren totali (n=26) 22,25

Sjögren senza ILD (n=17) 22,25

Sjögren con ILD (n=9) 22,66

SSc totali (n=30) 52,14 SSc con ILD (n=11) 52,14 SSc senza ILD (n=19) 45,85 Controlli sani (n=32) 79,18 Grafico 3. NHS SS SS+ILD SS-ILD 0 50 100 150 SS IL -8 ( p g /m l)

66 Dosaggio sierico di MCP-1/CCL-2

I pazienti con SS complicata da ILD non hanno mostrato avere valori di MCP-1 superiori rispetto ai controlli sani (41,30 pg/ml vs 49,60 pg/ml) ma sono risultati essere maggiori rispetto ai pazienti con SSc complicata da ILD (41,30 pg/ml vs 24,60 pg/ml). Nonostante questa evidente tendenza, non è emersa alcuna differenza significativa comparando i vari gruppi tra loro. I dati sono riassunti nella tabella 6 e rappresentati nel grafico 4.

Tabella 6. Livelli sierici di MCP-1/CCL-2 nelle popolazioni studiate

Pazienti Mediana (pg/ml)

Sjögren totali (n=26) 36,66

Sjögren senza ILD (n=17) 32,02

Sjögren con ILD (n=9) 41,30

SSc totali (n=30) 26,81 SSc con ILD (n=11) 29,14 SSc senza ILD (n=19) 24,68 Controlli sani (n=32) 49,60 Grafico 4. NHS SS SS+ILD SS-ILD 0 500 1000 1500 SS M CP -1 ( p g /m l)

67 Dosaggio sierico di RANTES/CCL-5

Nei pazienti con pSS e ILD i livelli sierici di RANTES/CCL5 sono risultati significativamente aumentati rispetto a quelli dei pazienti con SS-ILD (P=0,0020) ma non rispetto ai controlli sani.

A differenza di quello osservato nella SS, i livelli sierici di RANTES/CCL5 nei pazienti con SSc complicata da ILD erano sovrapponibili a quelli riscontrati nei pazienti con SSc senza ILD. I dati sono riassunti nella tabella 7 e rappresentati nel grafico 5 a) e b).

Tabella 7. Livelli sierici di RANTES/CCL-5 nelle popolazioni studiate

Pazienti Mediana (ng/ml)

Sjögren totali (n=26) 33,18

Sjögren senza ILD (n=17) 26,64

Sjögren con ILD (n=9) 43,32

SSc totali (n=30) 36,4 SSc con ILD (n=11) 37,4 SSc senza ILD (n=19) 29,7 Controlli sani (n=32) 38,7 Grafico 5. a NHS SS SS+ILD SS-ILD 0 50 100 150 SS P=0,0020 P=0,0441 RA NT E S ( n g /m l)

68 Grafico 5.b NHS SSc SSc+ILD SSc-ILD 0 50 100 150 200 SSc RA NT E S ( n g /m l)

69

8. CONCLUSIONI & PROSPETTIVE FUTURE

Lo sviluppo di ILD in corso di pSS rappresenta una grave complicanza della malattia, determinando un aumento della mortalità dei pazienti che ne sono affetti. Per questo motivo appare sempre più necessaria l’identificazione di marcatori sierici di ILD che oltre ad avere una rilevante utilità diagnostica possano anche costituire dei possibili bersagli terapeutici.

Il coinvolgimento polmonare in corso di pSS si manifesta con due quadri principali: la malattia ostruttiva, data dal coinvolgimento bronchiale, e ILD, quadro più grave ma anche molto meno frequente.

La letteratura (96, 83, 85, 129) infatti ha dimostrato che la malattia interstiziale polmonare è legata principalmente a meccanismi di immunità cellulo-mediata e ad un processo peri-epitelitico orchestrato dai linfociti T che invadono progressivamente il parenchima polmonare.

Scopo principale del presente studio è stato quello di valutare i possibili marcatori sierici di ILD in corso di pSS. A questo fine abbiamo ritenuto opportuno prendere in considerazione come possibili marcatori alcune chemochine (IL-8, MCP-1, RANTES), fattori chemotattici responsabili del reclutamento delle cellule infiammatorie a livello tissutale.

Abbiamo deciso di approfondire l’indagine valutando anche la parte finale del processo infiammatorio, ovvero il danno alveolare, attraverso la valutazione di due molecole associate rispettivamente al danno alveolare e alla fibrosi polmonare (KL- 6 e LL-37).

L’interesse nei confronti delle chemochine e del loro ruolo nella patogenesi di ILD secondaria a connettiviti è cresciuto esponenzialmente negli ultimi anni. Si sta delineando in maniera sempre più chiara come la funzione delle chemochine non sia limitata alla semplice chemiotassi dei monociti in corso di flogosi ma si estenda anche a un ruolo più articolato che si traduce nella regolazione dell’angiogenesi, nel controllo della proliferazione cellulare e nella modulazione dell’espressione di molecole di adesione. Attraverso tutti questi meccanismi tali molecole esercitano

70 un ruolo chiave nel complesso network di eventi che portano alla fibrosi polmonare.

Nel presente studio abbiamo scelto 3 chemochine coinvolte nel reclutamento di diversi tipi cellulari, ognuno dei quali in letteratura si è dimostrato avere un ruolo attivo sia nei processi dell’infiammazione che in quelli dell’angiogenesi e della fibrosi in corso di ILD: IL-8/CXCL8, secreta principalmente dai macrofagi alveolari e responsabile del reclutamento dei neutrofili in corso di alveolite neutrofila (220-221); MCP-1 /CCL-2, responsabile del reclutamento dei monociti e dei macrofagi (275-277), e, infine, RANTES/CCL5, secreto da macrofagi alveolari e responsabile del reclutamento dei linfociti T e, di conseguenza, dell’infiltrato linfocitario (239-241,258-261) . Per valutare se tali chemochine potessero svolgere un ruolo nei processi di fibrosi polmonare in corso di SS, abbiamo dosato i livelli circolanti di RANTES/CCL5, IL-8/CXCL8 e MCP-1/CCL2 in pazienti con pSS affetti o meno da ILD.

Il primo dato interessante che emerge da questo studio è legato al ruolo di RANTES nella patogenesi di ILD in corso di pSS. I livelli sierici di RANTES infatti risultano significativamente aumentati nei pazienti pSS con ILD . Interessante è inoltre che abbiamo potuto dimostrare che i livelli di RANTES nei pazienti affetti da pSS con ILD sono significativamente aumentati rispetto a quelli dei pazienti sclerodermici affetti da ILD, malattia del connettivo con una tendenza maggiore alla fibrosi polmonare. Questo dato rende RANTES non solo un marcatore sensibile di ILD in corso di pSS ma anche specifico per pSS. Il fatto che RANTES risulti aumentato nei pazienti con pSS e ILD anche rispetto ai pazienti con SSc-ILD potrebbe indicare che lo sviluppo di ILD in questa malattia non sia legato specificatamente all’attivazione dei linfociti T ma anche all’attivazione di molti altri tipi di cellule. Già è noto dalla letteratura (233, 258-261) che le popolazioni di linfociti T attivate da RANTES risultano essere gli attori principali nella patogenesi di ILD non associata a connettiviti: nel nostro lavoro abbiamo potuto confermarne il ruolo strategico anche in corso di ILD secondaria a pSS.

La letteratura ha evidenziato come RANTES sia associato principalmente a quadri NSIP di ILD (233). A maggior conferma del ruolo di questa citochina nello

71 sviluppo di ILD in corso di SS, il quadro più tipico di ILD nell’ambito della SS è proprio NSIP.

Il nostro studio ha voluto valutare l’ILD secondaria a SS anche in termini di danno alveolare. Per fare questo abbiamo dosato due molecole che dalla letteratura risultano essere associate rispettivamente al danno alveolare e alla fibrosi polmonare (KL-6 e LL-37) nei pazienti con ILD secondaria a connettivite (160- 161, 196-199).

I risultati confermano una tendenza di KL-6 ad aumentare nel siero dei pazienti affetti da pSS con ILD associata rispetto a quelli senza ILD e rispetto ai controlli sani anche se, forse a causa del ridotto numero di pazienti, tale dato non raggiunge la significatività statistica. Dall’analisi di KL-6, però, emergono alcune considerazioni. La prima riguarda il fatto che i più bassi livelli della molecola sono stati trovati in pazienti con quadro toracico completamente negativo. Al contrario, pazienti che presentavano alterazioni polmonari come bronchiettasie o coinvolgimento bronchiale, hanno mostrato valori elevati della molecola, indipendentemente dalla presenza di ILD. Questo renderebbe KL-6 un maker di coinvolgimento polmonare aspecifico, ma questo dato non trova al momento un consenso nella letteratura (242).

Riguardo a LL-37, non abbiamo potuto dimostrare alcuna associazione significativa tra pSS e ILD. Questo dato è in accordo con la letteratura (209,210), dove il ruolo di tale molecola nella fibrosi polmonare appare controverso.

In conclusione, il nostro studio è il primo in letteratura che ha indagato i marcatori sierici di ILD in corso di pSS e per la prima volta si è cercato di correlarli con marcatori di danno alveolare.

Il risultato più interessante è che RANTES è correlato con ILD secondaria a pSS e svolge quindi un ruolo strategico nella patogenesi di ILD in corso di SS attraverso il reclutamento dei linfociti T (CD4+ e CD8+).

A questo punto è necessario approfondire l’analisi di questa chemochina e il suo ruolo nella patogenesi di ILD in corso di pSS prima di tutto ampliando la coorte di pazienti usati e successivamente espandendo l’analisi a pazienti provenienti da più centri.

72 Nella pratica clinica quotidiana questi risultati, una volta confermati, si potrebbero traducono nella possibilità di individuare dei precisi target terapeutici per il controllo della fibrosi polmonare in corso di pSS.

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