Le specie reattive di maggior interesse biologico

Tabella 1 Forme dell’ossigeno presenti negli organismi viventi

Tra le specie reattive dell’ossigeno, l’ossigeno singoletto rappresenta una varietà radicalica che origina dall’eccitazione dell’ossigeno molecolare per assorbimento di una certa quota di energia, che comporta una transizione all’orbitale più esterno, o una loro inversione all’orbitale più esterno, o una loro inversione di spin. Il nuovo stato dell’ossigeno si comporta come un radicale libero estremamente reattivo, in grado di attaccare e danneggiare molecole ad alta densità elettronica, quali gli acidi grassi polinsaturi (come

SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO: Radicaliche

radicale idrossilico OH•

radicale superossido O2

• -

radicale ossido nitrico NO•

radicale perossido lipidico LOO•

Non radicaliche

perossido di idrogeno H2O2

ossigeno singoletto

acido ipocloroso HOCL

L’anione perossido risulta dall’addizione, ad una molecole di ossigeno, di un elettrone, il quale può provenire da diverse vie metaboliche.

Una volta generatosi, l’anione perossido può andare in contro alla reazionedi Fenton, generando il radicale molto istolesivo idroperossido, oppure dismutare a perossido di idrogeno, meno tossico.

Il radicale idrossile, molto istolesivo, può derivare da numerose reazioni, tra le quali la catena respiratoria, la fotolisi dell’acqua, la decomposizione del perossido di idrogeno e la reazione dell’ozono con i nitriti.

Infine il perossido di idrogeno viene generato soprattutto attraverso meccanismi di tipo enzimatico, e per via enzimatica è generalmente inattivato o dà luogo alla formazione di specie chimiche più ossidanti. È da ricordare che le specie reattive dell’ossigeno possono attaccare qualsiasi substrato organico, generando specie reattive secondarie (metaboliti reattivi dell’ossigeno).

SPECIE REATTIVE DELL’AZOTO Radicaliche Ossido nitrico diossido nitrico Non radicaliche acido nitroso tetrossido di azoto triossido nitrico perossinitrito acido perossinitroso

Tabella 2 Forme dell'azoto reattivo presenti negli organismi viventi

L’ ossido nitrico viene prodotto a partire dall’aminoacido L-arginina, in

una reazione catalizzata dall’enzima ossido nitrico sintetasi (NOS) il quale ha due domini ad azione catalitica, uno reduttasico e uno ossigenasico, e richiede come cofattore NADPH e pteridina ridotta.

L’ossido nitrico agisce come importante messaggero intra e intercellulare, regolando molte funzioni, e gioca un ruolo determinante nella difesa dalle infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori. Possedendo elettroni spaiati nell’orbitale più esterno è considerato una specie chimica radicalica e quindi reagisce rapidamente con altre specie aventi elettroni spaiati.

dell’NO e innesco di effetti tossici, con alterazioni cellulari funzionali e/o strutturali.

L’NO, essendo un radicale libero, può anche svolgere un’attività antiossidante, e la prevalenza di una o dell’altra azione dipende dalle concentrazioni relative delle singole specie reattive implicate.

3.2 Processi chimici e biologici che danno origine ai radicali liberi

Le specie chimiche reattive possono essere generate attraverso meccanismi enzimatici e non enzimatici. Una volta formatesi queste, possono dare inizio ad un processo propagativo caratterizzato da una serie di reazioni a catena nel corso delle quali il sito radicalico può essere trasferito o inattivato.

Origine specie radicaliche:

L’origine dei radicali può avvenire o per scissione omolitica o per interazione con metalli di transizione.

Scissione omolitica: Si assiste alla divisione di una molecola, a livello di

uno dei suoi legami covalenti, per effetto della somministrazione di energia, con la generazione di due nuove specie chimiche, ciascuna con un elettrone spaiato tipico dei radicali. Un esempio è la radiolisi o la fotolisi dell’acqua, che genera un atomo di idrogeno e un radicale idrossile.

Interazione con i metalli di transizione: Un altro meccanismo che ci porta

alla formazione di radicali liberi è l’interazione di molecole con metalli di transizione (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+…). Dobbiamo ricordare che quasi tutti gli enzimi conosciuti richiedono la presenza di ioni metallici per esprimere la propria attività catalitica.

Gli ioni metallici partecipano a reazioni di ossido-riduzione modificando in modo irreversibile il loro numero di ossidazione; si ottengono così elettroni in grado di spezzare il legame covalente di una molecola bersaglio, che si separa in un radicale libero e in un anione. Il metallo di transizione può anche ridursi in forma ionica richiedendo un elettrone, che viene estratto dal legame covalente di una molecola che si separa in un radicale libero e in un catione.

Tra i metalli di transizione, una notevole importanza biologica è rivestita dal ferro.

Nella reazione di Haber Weiss si osserva che, a partire da un radicale perossido e dal perossido di idrogeno derivato dalla propria dismutazione (reazione intramolecolare nella quale avviene un’ossido-riduzione interna, con la formazione di due distinti prodotti da un unico substrato), si ottiene una molecola di radicale idrossilico (HO●) ad alto potere ossidante.

H

O

+ O

HO

= OH

+ OH

+ O

Questa reazione è poco veloce, in modo tale da precludere una rilevanza biologica.

Il ferro è in grado di catalizzare la reazione con un meccanismo che è stato descritto per la prima volta da Fenton.

Lo ione ferroso (Fe2+), ossidandosi a ferrico (Fe3+), cede il suo elettrone ad una molecola di perossido di idrogeno (H2O2) scindendo uno dei legami

covalenti, generando un radicale libero (il radicale idrossilico HO•) e un anione, ione ossidrile (Verna F. et al., 2005).

A sua volta lo ione ferrico si riduce a ione ferroso strappando un elettrone da una seconda molecola di perossido di idrogeno, che è scissa in un radicale libero (un radicale peridrossile HOO•) e un catione (uno ione idrogeno).

O2

+ Fe

= Fe

+ O2

H

O

+ Fe

2+

= OH

+ OH

+ Fe

Negli organismi superiori, il ferro non è mai ferro libero o debolmente legato; esso viene trasportato nello stato ferrico dalla transferrina, in un complesso difficilissimo da ridurre. Allo stesso modo viene depositato nello stato ferrico mediante la ferritina, proteina ubiquitaria nei tessuti e nel plasma.

Il radicale in grado di ridurre allo stato ferroso il ferro legato alla ferritina, che viene poi rilasciato, è il radicale superossido. E’ questo ferro, liberato dalla produzione patologica di superossido, che è in grado di catalizzare la reazione di Haber Weiss. Il radicale idrossilico così prodotto può iniziare la perossidazione lipidica, che porta alla modificazione strutturale e funzionale delle membrane o può attaccare macromolecole e causare rotture del DNA. Se il ferro liberato può esacerbare la parte di danno tissutale dovuta alla produzione di radicali liberi, ha senso chiedersi se lo stato nutrizionale del ferro corporeo possa essere un fattore predisponente nelle patologie legate allo stress ossidativo (Flora S.J.et al., 2007),

Propagazione della specie radicalica:

Una volta che una reazione radicalica a catena viene innescata questa tende a propagarsi attraverso alcuni meccanismi, tra cui quello più comune è caratterizzato dal trasferimento del sito radicalico ad una molecola alla quale viene sottratto uno dei suoi atomi. Con questo meccanismo, ad esempio, il radicale ossidrile (HO●), attaccando una molecola organica (R-H), strappa a questa un atomo di idrogeno, generando, accanto ad una molecola d’acqua, un radicale alchilico (R●) (Iorio E.L., 2004).

HO

+ R-H = H2O + R

Interruzione della propagazione radicalica:

Una reazione a catena può arrestarsi per disproporzione o per combinazione, in cui si assiste alla reazione tra due radicali liberi che, interagendo, danno origine ad una molecola non più reattiva. Così il primo radicale agisce da ossidante, mentre il secondo da antiossidante.

Nei processi metabolici cellulari vengono continuamente generate specie chimiche reattive, ma la loro sintesi può essere incrementata da numerosi fattori esogeni di varia natura.

3.3 Siti fisiologici di formazione delle specie radicaliche

In questo capitolo esamineremo più nel dettaglio i diversi comparti cellulari che rappresentano siti di sintesi dei radicali liberi.

I mitocondri sono la fonte primaria di ROS perché, sulle loro

creste, sono situati i complessi enzimatici della catena respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa. Negli organismi aerobi gli elettroni provenienti da molecole energetiche ridotte vengono

rappresenta energia libera la quale viene conservata e poi usata per la produzione di ATP.

Gli elettroni rilasciati dall’ossidazione del glucosio vengono trasferiti a coenzimi NAD+ (nicotamide adenin di nucleotide) e FAD (flavin adenin di nucleotide), trasportatori di elettroni e, da questi, passano poi ad una catena di trasporto di elettroni attraverso una serie di ossido- riduzioni. Infine, per azione del citocromo C ossidasi, si ha l’ossidazione di quattro molecole di citocromo C e la riduzione di una molecola di O2 con produzione di ATP e

H2O.

Tale processo però è soggetto ad una certa percentuale di errore, in seguito alla quale una quota di elettroni (1-2%) sfugge al sistema di trasporti dei coenzimi e reagisce direttamente con l’ossigeno molecolare, generando un anione superossido (nel caso sia trasferito all’ossigeno un solo elettrone) e/o perossido di idrogeno (nel caso di aggiunta di un altro elettrone).

In caso di fosforilazione ossidativa la produzione di radicali liberi avviene senza l’intervento di enzimi.

Questi metaboliti dell’ossigeno, molto reattivi, hanno un ruolo importante nel determinare il danno tissutale in corso di diverse situazioni patologiche (Van Holde M., 1998). La quantità di superossido prodotta dai mitocondri aumenta con la concentrazione dell’ossigeno nell’organismo

(es. nell’iperventilazione), in caso di ridotta efficienza della catena respiratoria in cui il flusso di elettroni è limitato dalla mancanza di substrato da fosforilare (assenza di ADP e presenza di substrato e ossigeno), o per azione di tossici e agenti disaccoppianti la fosforilazione ossidativa che riducono l’utilizzo dell’ossigeno.

uccidono i microrganismi, mostrano una esplosione del consumo di ossigeno non mitocondriale, dovuta alla produzione di perossido di idrogeno.

Nella membrana di queste cellule sono localizzati diversi enzimi come la NADPH ossidasi e le lipossigenasi, la cui attivazione si accompagna alla produzione, rispettivamente, di anione superossido e di intermedi metabolici con caratteristiche simili ai perossidi. Il ruolo battericida dei radicali e dei loro metaboliti (H2O2 e HOCl) si basa su di una NADPH

ossidasi (l’unico enzima dell’organismo a produrre superossido in modo non casuale ma programmato), che catalizza la formazione di anione superossido da NADPH(H+) e ossigeno molecolare, in seguito a stimolazione specifica dei polimorfonucleati da parte di endotossine, batteri, anticorpi,ecc.

La produzione dei ROS a livello della membrana plasmatica dei PMN avviene in corso di processi reattivi (infezioni, immunoreazioni patogene, infiammazioni, allergie), ed i segni tipici della flogosi sono i risultati dell’attivazione radicalica dei neutrofili richiamati in situ.

Questo meccanismo è molto importante tanto che l’incapacità genetica a produrre superossidi causa la condizione nota come malattia granulomatosa cronica, nella quale i neutrofili hanno grosse difficoltà a uccidere i microrganismi fagocitati, con il risultato di infezioni ricorrenti e spesso setticemie.

Anche i perossisomi rappresentano una fonte importante di ROS. In questi organuli cellulari avviene un particolare processo di ß ossidazione degli acidi grassi in cui la flavoproteina estrae una coppia di atomi di idrogeno da una molecola di acido grasso attivato

Nel reticolo endoplasmatico la produzione di specie reattive passa attraverso il citocromo P450, il quale agisce come donatore immediato di elettroni in molte reazioni di idrossilazione, in particolare quelle che avvengono all’interno degli epatociti e che sono finalizzate all’inattivazione di ormoni e composti non fisiologici come gli xenobiotici.

3.4 Sintesi di radicali liberi nei processi reattivi

Da quanto scritto sopra è chiaro che i ROS rappresentano intermedi obbligati del metabolismo e, in alcuni casi, la loro produzione rappresenta un passaggio essenziale per l’esplicazione di importanti meccanismi fisiologici.

3.4.1 Produzione di radicali liberi in corso di flogosi:

In ogni distretto cellulare la produzione di specie reattive ha una sua specifica funzione non solo nel fisiologico metabolismo, ma anche nei processi reattivi, quali infezioni e infiammazioni, e in particolare per quanto riguarda i radicali liberi prodotti a livello della membrana dei PMN. Questo tipo di attività immunologica si estrinseca non solo nei confronti di componenti estranei, ma anche contro componenti self quali tessuti o organi trapiantati (reazioni di rigetto), e nei processi di guarigione di organi e tessuti traumatizzati. Accade che i leucociti migrino nelle aree lese, si attivino, inizino a bombardare le cellule danneggiate con i radicali liberi i quali accelerano la loro distruzione, l’allontanamento dei prodotti di lisi e il

Poiché i PMN sono coinvolti in quasi tutti i processi patologici, indipendentemente dal meccanismo patogenetico e poiché i PMN rappresentano la fonte maggiore di produzione dei radicali liberi, quest’ultimi sono comuni a tante patologie.