Nei risultati precedentemente descritti sono state impiegate le seguenti linee di NS murine: LC1 GFP (linea derivata a partire da cellule ES e resa GFP positiva mediante traduzione virale, Conti et al., 2005); Cor1 GFP (linea derivata da corteccia fetale di topi a E16 e resa GFP positiva in seguito ad elettroporazione con il vettore plasmidico pCAG-GFP,; Conti et al., 2005); NS 14 CX (linea derivata da corteccia fetale di topi GFP a E14; Onorati et al., 2010); CX 16 RFP (linea derivata da corteccia fetale di topi CAG-mRFP a E16); NS YFP (linea derivata da corteccia fetale di topi R26R-YFP a E16); Cre 16 CX (linea derivata da corteccia fetale di topi CMV-Cre a E16). Inoltre è stata utilizzata una linea di neurosfere denominata L14 GFP (le neurosfere sono state derivate da corteccia fetale di topi GFP a E14) la quale è stata derivata e mantenuta in vitro come descritto precedenti da altri autori (Reynolds e Weiss, 1992). Le cellule NS sono state mantenute in proliferazione in condizioni di coltura in monostrato in piastre non trattate con laminina e cresciute nel medium Euromed-N (Euroclone, CELBIO) addizionato con EGF 20 ng/ml, FGF 20ng/ml (Prepotech, TebuBio) e N2 1% (Invitrogen, GIBCO) (Conti et al, 2005).
La procedura di pre-differenziamento consiste nel piastrare le cellule NS ad una densità di 4 x 105 cellule/cm2 in fiasche da 25 cm2, prive di trattamento con laminina, in medium Euromed-N (Euroclone, CELBIO) addizionato con N2 all 0.5%, B27 allo 1.5% (Invitrogen, GIBCO) e FGF-2 10 ng/ml (Prepotech, TebuBio) per 3 giorni.
Dove specificato, le cellule NS prima di essere trapiantate sono state marcate con il colorante lipofilico DiI (Vybrant DiI solution, Molecular Probes) il quale è stato addizionato al medium un’ora prima del trapianto per un tempo di 20 minuti e poi eliminato in seguito a 3 lavaggi con medium caldo, ciascuno di 10 minuti.
Il test per identificare la presenza della proteina virale p24 nel medium delle cellule NS è stato effettuato mediante test ELISA (PerkinElmer p24 ELISA Kit Assay).
4.2 Derivazione astrociti primari e cellule microgliali
La derivazione degli astrociti primari e delle cellule microgliali, entrambi utilizzati per gli esperimenti di co-coltura con le NS, è stata effettuata a partire da corteccia di topi transgenici per la GFP o RFP a P1-P3. La corteccia viene dissezionata e ripulita dalle meningi in HBSS. Una volta dissezionato, il tessuto corticale viene digerito in tripsina e la sospensione cellulare che si forma, filtrata con un filtro a 40 µm, centrifugata e risospesa in mezzo DMEM addizionato con FBS (fetal bovine serum) 20%. Le cellule così ottenute vengono piastrate in fiasche da 75 cm2 e cresciute a 37°C in presenza di CO
2 al 5%. Dopo 10 giorni dalla piastratura
delle cellule, per ottenere cellule microgliali, è necessario agitare la fiasca a 200 rpm per 2 hours. A questo punto le cellule microgliali si staccheranno, mentre gli astrociti resteranno adesi. Le cellule della microglia che si trovano in sospensione, vengono raccolte, centrifugate e ripiastrate in multiwell da 4 pozzetti ad una densità di 2 x 105 cellule/pozzetto in medium DMEM addizionato con FBS al 10%. Le
colture arricchite in microglia che si ottengono sono composte per il 95% da cellule microgliali, questo confermato anche da immonoistochimica in fluorescenza condotta con un anticorpo specifico contro il marcatore della microglia, IBA1.
Dopo avere staccato la microglia, gli astrociti rimasti adesi vengono staccati mediante l’utilizzo di tripsina allo 0.05% e piastrati in una miltiwell da 4 pozzetti ad una densità di 2 x 105 cellule/pozzetto e cresciute a 37°C in presenza di CO
2 al 5%.
Le colture arricchite in astrociti che si ottengono sono composte per il 95% da cellule astrocitarie, questo confermato anche da immonoistochimica in fluorescenza condotta con anticorpo specifico contro il marcatore degli astrociti GFAP.
4.3 Derivazione colture primarie di ippocampo
Le colture primarie derivate da ippocampo sono state ottenute da tessuto cerebrale derivato da cervello di topi transgenici per la GFP oppure RFP a E18. (Babu et al., 2007). In breve, entrambi gli ippocampi vengono prelevati dal cervello embrionale e raccolti in HBSS. Dopodichè vengono dissociati mediante digestione con tripsina e deossi-ribonucleasi per 5 minuti. Una volta rimosso gli enzimi con 2
lavaggi in PBS1X, le cellule ottenute vengono filtrate con un filtro a 40 µm, cenrifugate e poi piastrate in multiwell da 4 pozzetti trattate con laminina (3 µg/ml) ad una densità di 2 x 105 cellule/pozzetto. La coltura cellulare viene mantenuta in
condizioni proliferanti in mezzo Neurobasal addizionato con B27 2%, N2 1%, FGF- 2 20 ng/ml e EGF 20 ng/ml (human recombinant; Prepotech, TebuBio) e cresciute a 37°C in presenza di CO2 al 5%.
4.4 Preparazione co-colture
Le co-colture vengono effettuate tra cellule NS derivate da tessuto fetale GFP+ oppure RFP+ in condizioni sia proliferanti che pre-differenziate, e cellule
microgliali o astrociti primari derivati da topi transgenici GFP o RFP.
La co-coltura tra astrociti e cellule NS viene piastrata in proporzioni 1:1 nel medium di mantenimento delle NS, mentre la co-coltura tra cellule microgliali e cellule NS viene piastrata in rapporto di 2:1, nel medium delle NS. La co-coltura tra cellule NS e progenitori ippocampali viene pilastrata in proporzione di 1:1 nel medium di proliferazione. Le cellule sono state osservate sulla base della loro fluorescenza endogena a diversi tempi dalla co-coltura. Inoltre, agli stessi tempi in cui sono state osservate vive, sono state analizzate in seguito ad esperimenti di immunoistochimica.
4.5 Animali
Gli animali vengono stabulati in gabbie apposite in un numero di 3-4 animali per gabbia con libero accesso a cibo ed acqua. Sono mantenuti in stanze a temperatura controllata (22°C) in cicli giorno/notte di 12 ore (7:00/19:00). Tutte le procedure sperimentali sono quelle previste ed approvate dal Ministero della Salute
Guida per il mantenimento ed utilizzo degli animali da laboratorio.
Gli esperimenti di trapianto sono stati condotti utilizzando i seguenti ceppi murini: ROSA26 (Soriano et al., 1999), Z/AP (Lobe et al., 1999), R26R-YFP (Srinivas et
al., 2001), CMV-Cre (Su et al., 2002) , R6/2 (Mangiarini et al., 1996), CAG-mRFP1
(Long et al., 2005) 129 s/v (Charles River, Italy), CD-1 Nude mice (Charles River, Italy) e C57BL6/J (Charles River, Italy).
4.6 Trapianti e processamento tessuti
Per la chirurgia dei trapianti gli animali vengono anestetizzati con Ketamina e Xylazina (100 and 10 mg/kg i.p. respectively), ed iniettati in modo stereotassico con 1 µl (2,5 x 105 cellule/µl) di sospensione cellulare di NS in ippocampo in the (hp), striato (st) e corteccia (ctx) (le coordinate in mm from Bregma sono: hp -1,46 A-P ±1,5 M-L -2,3 D-V; st 0,7 A-P ± 2,0 M-L -3,5 D-V; ctx -0,40 A-P ±1,4 M-L -1 D-V dalla Dura Madre). Gli animali sono stati trapiantati ad un’età compresa tra le 3-4 settimane di età ad eccezione dei topi R6/2 (9-10 settimane). Per gli esperimenti condotti utilizzando la BrdU ai fini di marcare una parte dei progenitori ippocampali, topi P20 129 s/v wild-type sono stati iniettati ogni 6 ore per un giorno con una soluzione di BrdU (50mg/kg) per via intraperitoneale (Taupin, 2007) gli animali così trattati sono stati trapiantati in acuto oppure dopo 3 settimane dall’ultima iniezione di BrdU.
4.7 Immunoistochimica
I tessuti perfusi ed espiantati vengono post-fissati in PFA 4% o/n a 4°C. Il giorno seguente equilibrati in Saccarosio al 20% e poi tagliati al criostato (Leica Microsystem) in sezioni coronali seriali di 30µm di spessore e posti su vetrini Superfrst Plus (Thermo Scientific). I vetrini vengono lasciati in una soluzione di Blocking (NGS 10% e TritonX-100 0,3%) per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Dopodichè vengono posti o/n RT nella stessa soluzione di Blocking ma in presenza di siero all’1% addizionato con l’anticorpo primario appropriato. Il giorno seguente i vetrini vengono posti in PBS1X (3 lavaggi da 10 minuti ciascuno) per eliminare la quantità di anticorpo in eccesso e successivamente incubate con un anticorpo secondario coniugato con una fluoroforo (1:500 Alexa, Molecular Probes) a RT per 1 ora.
Per il rivelamento della BrdU le sezioni vengono trattate, prima del passaggio di Blocking, con HCl 2N per 30 minuti a RT e a seguire 3 lavaggi da 10 minuti ciascuno con Acido Borico 0.1M pH 8.8 per riequilibrare il pH, e poi trattate come descritto precedentemente.
Le diluizioni e gli anticorpi utilizzati per questo lavoro sono: anti-BrdU (1:400, Becton Dickinson); rabbit anti-GFP (1:500, Invitrogen; used also for YFP detection); chicken anti-GFP (1:1000, Abcam); rabbit ani-βGal (1:1000, Cappel); rabbit anti-IBA1 (1:1000, Wako); rabbit anti-GFAP (1:1000, Dako); rabbit anti-RFP (1:1000, Abcam); goat-anti-RFP (1:1000, Santa Cruz); mouse anti-NeuN (1:50; Millipore), mouse anti-EM48 (1:300, Millipore), Hoechst (1:10,000, Molecular Probes).
4.8 Ibridazione in situ
I tessuti ottenuti da animali perfusi con PFA 4% e trattati come descritto nella sezione immunoistochimica, vengono processati con una sonda antisenso ad RNA generata mediante retrotrascrizione in vitro con RNA polimerasi T7 o T3 (Roche) e marcata con digossigenina-11-UTP (Roche). L’ibridazione in situ sui tessuti è stata eseguita seguendoli protocollo descritto in Croci et al., 2006.
4.9 Immunocitochimica
Le analisi di immunocitochimica sono state condotte su cellule fissate in PFA 4% per 10 minuti a RT, lasciate per 1 ora a RT nella soluzione di Blocking (NGS 5% TritonX-100 0.5%) e incubate o/n nella soluzione di Blocking addizionata con l’anticorpo primario appropriato (NGS 1%, TritonX-100 0.1%) o/n a 4°C. Il giorno seguente vengono eseguiti 3 lavaggi in PBS1X e le cellule rivelate con un anticorpo secondario coniugato con un fluoroforo (1:500 Alexa, Molecular Probes) per 1 ora a RT.
Le diluizioni e gli anticorpi utilizzati per questo lavoro sono: rabbit anti- GFP (1:1000, Invitrogen); rabbit anti-IBA1 (1:1000, Wako); rabbit anti-GFAP (1:1000, Dako); goat-anti-RFP (1:1000, Santa Cruz); Hoechst (1:10,000, Molecular Probes).
4.10 Analisi delle immagini
Le immagini dei tessuti mostrate in questo lavoro sono state acquisite ed analizzate mediante microscopio confocale, sia Leica (TCS-SP2) che Zeiss (LSM- 510) e digitalizzate con il software ImageJ. Le immagini mostrate riguardanti le co-
co-colture cellulari sono state ottenute con il microscopio invertito in fluorescenza Leica (DMI6000B) ed elaborate mediante il software ImageJ.
4.11 Esperimenti di Time-lapse
Gli esperimenti in Time-lapse sulle co-colture sono stati condotti utilizzando la stazione di video microscopia in time-lapse Leica AF7000. I tempi di registrazione sono stati calcolati partendo da 1 ora dopo la co-coltura e le immagini collezionate ogni 10 minuti per 72 ore. Durante tutto l’esperimento di time-lapse e cellule vengono mantenute a 37°C con CO2 al 5%. I filmati dei time-lapse sono stati analizzati e visualizzati grazie a software Leica dedicati.