Trapianto di cellule NS in ippocampo di topo adulto: generazione di cellule con morfologia ed orientamento tipico dei neuroni endogeni.

3.1.1 Analisi del comportamento di cellule NS Cor1 GFP dopo trapianto in ippocampo

Studi condotti precedentemente in laboratorio hanno osservato il comportamento generale di cellule NS proliferanti in seguito a trapianto in striato di topi adulti, dimostrando la capacità di queste cellule di sopravvivere nel tessuto ospite e di generare elementi cellulari sia MAP2+ _{che GFAP}+ _{(Conti et al., 2005).}

In questi studi però la morfologia osservata delle cellule trapiantate era quella di neuroni immaturi, dunque le condizioni in cui le cellule venivano mantenute in vitro e poi trapiantate, non erano in grado di far valutare completamente la capacità neurogenica di queste cellule.

Per rispondere a questa domanda, inizialmente abbiamo testato il comportamento di cellule NS GFP+ derivate da tessuto fetale, denominate Cor1- GFP, dopo trapianto in ippocampo di topi adulti sia in condizioni proliferanti che sottoposte ad un protocollo di pre-differenziamento in vitro (Fig1) durante il quale le cellule vengono esposte per tre giorni ad un protocollo di differenziamento neuronale (Spiliotopoulos et al., 2009).

Figura 1: Schema sintetico che mostra come le cellule NS derivate da tessuto fetale e coltivate in

monostrato in condizioni proliferanti possono essere indotte a pre-differenziare per poi essere trapiantate in cervello di topo adulto. (prolif. = proliferanti; pre-diff= pre-differenziate)

Il pre-differenziamento in vitro delle Cor1GFP è stato effettuato ai fini di incrementare le loro potenzialità di differenziamento dopo trapianto e quindi promuovere la loro integrazione nel tessuto ospite. Inizialmente ho trapiantato le cellule in ippocampo di topi adulti wilde-type eseguendo un trapianto singenico, cioè cellule derivate da uno specifico ceppo murino, in questo caso s/v 129, impiantate in topi riceventi appartenenti allo stesso ceppo murino da cui derivano le cellule. Gli animali così trattati sono stati sacrificati a tempi precoci, 6 e 24 ore dal trapianto, ed a tempi più tardivi, 3 e 7 giorni dal trapianto, ed i rispettivi ippocampi processati mediante analisi per immunoistochimica in fluorescenza utilizzando un anticorpo specifico contro la eGFP. I risultati ottenuti mostrano, sia a tempi precoci (Fig. 2A e B) che a tempi tardivi (Fig. 2C e D), la presenza di un buon numero di cellule GFP+ nel giro dentato (DG) dell’ippocampo e che la loro distribuzione e morfologia cellulare cambia con il passare del tempo.

Figura 2: Immunofluorescenza contro la GFP, eseguita su sezioni coronali di ippocampo di topo

adulto trapiantato con cellule Cor1 GFP pre-differenziate, a 6 (A), 24 (B) 72 (C) ore e una settimana (D) dopo il trapianto. I riquadri in A, B e C mostrano i graduali cambiamenti di morfologia delle cellule

nel tempo. Sette giorni dopo il trapianto si osserva la comparsa di cellule GFP+ _{con morfologia identica}

a quella delle cellule dei granuli del DG (freccia in D). La linea tratteggiata indica i confini dello strato dei granuli del DG. Scale bars: 500 µm (A-C) e 100 µm (D)

Infatti, sette giorni dopo il trapianto, si osserva la comparsa di cellule GFP+

che mostrano morfologia, orientamento e posizione tipica delle cellule dei granuli del giro dentato dell’ippocampo (Fig. 1D) mentre a stadi più precoci le cellule mostrano una morfologia tipica di neuroni immaturi (Fig. 2A-C). Ho osservato gli stessi risultati anche trapiantando le cellule in condizioni proliferanti (Fig. 3A-D) anche se, in queste condizioni, la frequenza della comparsa di cellule GFP+ con morfologia simile alle cellule dei granuli del DG dell’ippocampo 7 giorni dopo il trapianto è molto più bassa (Fig. 1D). Mentre un mese dopo il trapianto la frequenza della comparsa delle cellule GFP+ _{con fenotipo neuronale aumenta (dato non}

mostrato).

Figura 3: Sezioni coronali di ippocampo di topo adulto trapiantato con cellule Cor1 GFP proliferanti e

processate mediante Immunofluorescenza contro la GFP a 6 (A), 24 (B) 72 (C) ore e una settimana (D) dopo il trapianto. Una settimana dal trapianto si osserva la comparsa di cellule GFP+ _{con morfologia}

identica a quella delle cellule dei granuli del DG (freccia, D). Scale bars: 500 µm (A-C) e 100 µm (D) 3.1.2 Analisi del comportamento di cellule NS-ES LC1 GFP dopo trapianto in ippocampo

Un comportamento simile è stato osservato in seguito a trapianto in ippocampo di topi adulti di NS derivate da cellule ES denominate LC1 GFP (Conti et al., 2005), anche in questo caso le cellule sottoposte a pre-differenziamento in

vitro mostrano lo stesso comportamento osservato per le NS Cor1GFP, anche se

necessitano di un tempo maggiore, un mese, prima di dare origine a cellule GFP+ con morfologia neuronale matura. Il segnale della GFP è stato osservato in un gran numero di cellule posizionate lungo tutto l’ippocampo, molte delle quali con morfologia ed orientamento simile a quello dei neuroni piramidali ippocampali endogeni, inoltre, anche in questo caso, sono state osservate cellule GFP+ _con

morfologia identica a quella dei granuli del DG dell’ippocampo (Fig. 4A).

Figura 4: Sezione coronale di ippocampo di topo adulto trapiantato con cellule NS derivate da ES LC1

GFP pre-differenziate e processate contro la GFP un mese dopo il trapianto. La presenza di cellule GFP+ _{con una morfologia neuronale si osserva in tutti gli starti piramidali dell’ippocampo (i.e. CA1) e}

del giro dentato DG. Inoltre è presente anche una buona quantità di processi GFP+ _{che si disperdono in}

tutto il tessuto. Scale bar 100 µm.

Oltre a trapianti a breve termine, è stato analizzato anche il fenotipo delle cellule Cor1 GFP dopo 3 (Fig. 5A) e 18 mesi (Fig. 5B) dal trapianto in ippocampo. I risultati ottenuti mostrano che le cellule sono capaci di sopravvivere anche dopo diversi mesi dal trapianto d ando origine a cellule GFP+ _{con morfologia neuronale}

Figura 5: Immunofluorescenza contro la GFP condotta su sezioni coronali di ippocampo di topo adulto

trapiantato con cellule Cor1 GFP pre-differenziate e sacrificato a 3 (A) e 18 (B) mesi dopo il trapianto. Scale bar 50 µm.

3.1.3 Analisi della morfologia e quantificazione di cellule NS Cor1 GFP dopo trapianto in ippocampo

Dopo aver effettuato un’ analisi prevalentemente basata sull’osservazione del comportamento nel tempo delle cellule trapiantate, ho condotto un’ analisi basata esclusivamente sulla morfologia delle cellule GFP+ _{(Fig. 6A).}

Due giorni dopo il trapianto più del 70% delle cellule GFP+ _{mostrano una}

morfologia tipica di cellule indifferenziate, mentre a sette giorni dopo il trapianto circa l’80% delle cellule GFP+ _{mostrano una morfologia ‘differenziata’ in quanto le}

cellule mostrano processi neurali ramificati e orientamento non casuale rispetto al tessuto in cui sono state impiantate (Fig. 6B).

B        

Figura 6: In A sono rappresentati dei riquadri che identificano le NS Cor1 GFP pre-differenziate sulla

base della morfologia che acquisiscono a diversi tempi dopo il trapianto in ‘indifferenziate’, ‘intermedie’ e ‘differenziate’. Il grafico (B) mostra la percentuale di cellule con i tre diversi fenotipi a 2, 4 e 7 giorni dopo il trapianto.

In tutti gli esperimenti di trapianto di cellule Cor1GFP effettuati (n=400), ho osservato una media di circa 515 ± 193 cellule GFP+ _{in ippocampo con morfologia}

neuronale matura (Fig. 7), quindi tenendo conto che le cellule trapiantate inizialmente sono 250.000, solamente lo 0,2% del totale delle cellule iniettate sopravvive dopo il trapianto, e di queste approssimativamente l’85% mostra un fenotipo neuronale maturo (Fig. 6A).

Figura 7: Grafico che mostra il numero di cellule GFP+ _{con morfologia neuronale presenti in 15 diversi}

trapianti. Gli animali utilizzati per effettuare la conta delle cellule sono stati trapiantati con cellule Cor1 GFP pre-differenziate e sacrificati una settimana dopo il trapianto.

3.1.4 Analisi del comportamento di diverse linee di NS dopo trapianto in ippocampo

Per capire se il comportamento osservato con le cellule NS Cor1 GFP fosse specifico di questa linea cellulare oppure una caratteristiche biologica generale delle cellule NS di derivazione fetale, ho trapiantato diverse linee di NS derivate da fonti diverse. In particolare ho trapiantato cellule NS denominate CX 16 RFP derivate da tessuto fetale di topi transgenici ds-RFP (Fig. 8A), cellule NS denominate 14 CX

GFP, derivate da tessuto fetale di topi transgenici GFP (Fig. 8B) e cellule NS denominate L14-GFP cresciute sotto forma di neurosfere e derivate da tessuto fetale di topo transgenico GFP (Fig. 8C). Tutte e tre le linee cellulari hanno originato cellule GFP+ _{o RFP}+ _{con morfologia tipica dei neuroni dei granuli del DG}

dell’ippocampo, anche se con una efficienza minore rispetto alle Cor1 GFP e LC1 GFP (circa 20-30 cellule GFP+ _{o RFP}+ _{derivate dal trapianto delle due linee di NS e}

circa 5-10 cellule GFP+ _{dopo trapianto delle neurosfere). In tutti i trapianti effettuati}

con diverse linee di cellule NS e neurosfere, non ho mai osservato formazioni tumorali.

Figura 8: Ingrandimenti di sezioni coronali di ippocampi di topi 129 s/v adulti trapiantati con NS fetali

CX 16 RFP (A), 14 CX GFP (B) e neurosfere L14 GFP (C). I tessuti sono stati processati per immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici contro la RFP e la GFP. Scale bar 40 µm

3.2 Il comportamento delle cellule donatrici dopo trapianto in ippocampo è