MATERIALI E METODI

Animali

Per questo studio sono stati utilizzati 10 ratti adulti Sprague Dawley di peso compreso tra 320 e 450g e con un’età media di 7-8 mesi. Gli animali prima e dopo l’operazione sono stati tenuti in una stanza a temperatura e umidità controllate , con cicli luce/buio di 12 ore/12 ore e sono stati nutriti ed idratati ad libitum.

MNPs

Le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro (Fe3O4) sono state sintetizzate con

una variante modificata del metodo di idrolisi ossidativa (cioè la precipitazione di un sale di ferro in un mezzo basico con un lieve ossidante) 216. Nello specifico è stato prodotto in situ un rivestimento polimerico aggiungendo poli-etilen-imina (PEI, 25 kDa) durante la reazione, come descritto in un precedente lavoro 217. La poli-etilen-imina ha la funzione di prevenire l’aggregazione delle particelle e di aumentarne la biocompatibilità.

Procedura Chirurgica

Tutti i ratti sono stati operati su entrambi gli arti superiori, in modo da utilizzare un nervo mediano (il sinistro) come modello sperimentale e l’altro (il destro) come controllo negativo.

Gli animali sono stati sottoposti ad anestesia generale con Zoletil (Tiletamina + Zolazepam) 40 mg/Kg e Xilor (Xilazina) 7,5 mg/Kg per via intraperitoneale e sono stati operati con l’ausilio di un microscopio operatorio con ingrandimento 40X (OPTIKA SZM-B) e di strumenti microchirurgici, quali pinze n.3 e n.5, portaaghi e forbici rette (Figura 23A). Dopo l’anestesia, si è proceduto con la preparazione della cute (rasatura) su entrambi le regioni ascellari e con il posizionamento del

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ratto in posizione supina sul tavolo operatorio con gli arti superiori fissati in abduzione ed extra-rotazione a 90° (Figura 23B).

Cominciando dall’arto superiore destro, si è applicata una dose di anestetico locale (pomata cutanea EMLA) e poi si è praticata un’incisione longitudinale anteriore di circa 3 cm dall’ascella al gomito per avere accesso al fascio vascolo-nervoso dell’arto. Subito al di sotto del piano cutaneo si trova il muscolo grande pettorale, al di sotto del quale emergono il nervo mediano e ulnare con decorso medio- laterale, il primo di calibro leggermente maggiore del secondo. Con l’aiuto del microscopio è stata eseguita un’attenta dissezione per risparmiare l’arteria brachiale e la vena basilica onde evitare gravi alterazioni periferiche dell’arto superiore dovute a ischemia tessutale. Il nervo mediano, a livello del braccio, non emette ramificazioni e decorre ventralmente rispetto al nervo ulnare, separato da esso dall’arteria ascellare. Il nervo mediano è stato isolato per tutto il tratto dal muscolo gran pettorale fino al gomito, prestando molta attenzione a non ledere l’arteria ascellare. È stato poi posizionato sotto al nervo un piccolo sfondo per creare un contrasto (Figura 23C). A questo punto è stata iniettata a monte della sede di sezione un anestetico locale (Carbosen 2% flacone da 1 ml; principio attivo: Mepivacaina Cloridrato), dopo di che il nervo è stato sezionato con forbici microchirurgiche rette.

Nella fase successiva un tubicino in silicone (diametro esterno 2 mm, diametro luminale 1 mm e lunghezza 5 mm) è stato suturato prima al moncone prossimale con un punto ad U eseguito con filo di nylon 9-0 (Sharpoint Black monofilament), poi al suo interno è stata iniettata della soluzione fisiologica (controllo negativo), infine, con lo stesso tipo di sutura, anche l’altra estremità del tubicino è stata suturata al moncone nervoso distale (Figura 23D).

Dopo l’impianto è stato verificato che non ci fossero sanguinamenti e la cute è stata chiusa con una sutura in Vycril 4-0 a punti staccati e poi disinfettata con Betadine.

Terminata la procedura chirurgica a destra, la stessa è stata ripetuta sull’arto superiore sinistro. I passaggi chirurgici sono stati identici, tuttavia su questo lato

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nel tubicino di silicone è stata iniettata la soluzione contente le nanoparticelle magnetiche alla concentrazione di 1,1 µg/ml (Figura 23E).

A B

C D

D

Figura 23. A) Strumenti microchirurgici; B) Posizione del ratto sul supporto operatorio; C) Preparazione del nervo mediano; D) Tubulo di silicone suurato ai due monconi nervosi contenente soluzione fisiologica; D) Tubulo in silicone suturato ai due mononi nervosi contenente la soluzione di MNPs.

Gli animali sono stati poi monitorati giornalmente a seguito dell’intervento chirurgico allo scopo di prevenire eventuali fenomeni di ulcerazione della pelle, diastasi della ferita chirurgica ed auto-mutilazioni.

I ratti sono stati suddivisi in più gruppi sperimentali: nel I gruppo l’espianto del tubulo in silicone con i due monconi nervosi è stato eseguito a 1 settimana

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dall’impianto, il II gruppo a 2 settimane e il III gruppo a 4 settimane, per studiare le varie fasi della rigenerazione nervosa.

Per ogni ratto al momento dell’espianto, immediatamente dopo il sacrificio, prima da un lato e poi dall’altro, è stato esposto il nervo mediano ed è stato sezionato a monte e a valle del tubicino impiantato, in modo da prelevare il tubicino con i due monconi nervosi.

Questo progetto è stato approvato dal Comitato Etico in accordo con la direttiva Europea del 24 Novembre 1986 (86/609/EEC) e con le attuali norme vigenti sul benessere degli animali da sperimentazione.

Istochimica

I nervi espiantati sono stati fissati in formalina per 1 ora, dopo di che sono stati disidratati, chiarificati in xilene ed inclusi in paraffina. Le sezioni sono state ottenute con un microtomo (14 µm) e sono state colorate con Blu di Prussia, seguendo le istruzioni del produttore (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per la marcatura in blu delle MNPs, e con pararosanilina per colorare i nuclei e i citoplasmi; in alternativa sono state immerse per 5 minuti in blu di toluidina 0,1% w/v in borato 0,1% w/v, lavate in acqua e montate con Eukitt.

Il Blu di Prussia (detto anche azzurro di Berlino) è un pigmento blu, stabile alla luce, ottenuto trattando con un sale ferrico una soluzione di ferrocianuro potassico. Essendo un colorante con affinità per il ferro, è utilizzato per colorare di azzurro selettivamente le nanoparticelle (costituite da ossido di ferro).

Il blu di toluidina è invece un colorante comunemente utilizzato per le cellule nervose.