NANOTUBI E SCAFFOLD NANOSTRUTTURATI

3.1.1NANOTUBI

I Nanotubi sono delle nanostrutture tubulari che possono essere costituite da vari materiali, quali carbonio, polimeri sintetici, DNA, proteine, lipidi, silicio e vetro. Tra i vari tipi di nanomateriali, i nanotubi di carbonio hanno attirato sempre più l'attenzione a causa delle loro proprietà meccaniche, elettriche, termiche, ottiche e strutturali. Essi sono stati scoperti da Sumio Iijima nel 1991 149 e sono costituiti da atomi di carbonio con strutture simili alla grafite, con anelli a 5 o 7 atomi. I Nanotubi di carbonio (CNT) hanno ottime proprietà che li hanno resi interessanti per l'applicazione clinica: piccole dimensioni, flessibilità, forza, inerzia, conducibilità elettrica e facilità di combinazione con vari composti biologici 150. I nanotubi di carbonio non sono biodegradabili e possono essere sia a parete singola che a parete multipla (SWCNT e MWCNT). Essi vengono prodotti a partire dal grafene, un materiale costituito da uno strato monoatomico di atomi di carbonio che, quando viene “arrotolato” può dare luogo ad un cilindro a parete singola (SWCNT ) oppure, se arrotolato più volte in modo concentrico, a una struttura multiparete (MWCNT) (Figura 18).

Figura 18. A) Singola lamina in grafene; B) Nanotubo a singola parete (Single-Walled CNT); C) Nanotubo multiparete (Multi-Walled CNT)

I Nanotubi con diametri definiti che vanno da 1 nm (nanotubi a parete singola) a 10-100 nm (nanotubi a parete multipla), grazie alle tecnologie attualmente disponibili, possono essere prodotti in modo altamente controllato. Questi diametri

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sono simili a quelli di piccole fibre nervose, dei coni di crescita e dei contatti sinaptici.

I CNT puri, non funzionalizzati, tendono ad essere insolubili nella maggior parte dei solventi 151 rendendo difficile il loro impiego in ambito biologico. Inoltre, alcuni CNT senza funzionalizzazione hanno dimostrato di essere citotossici 152,153.

Pertanto, per integrare i CNT nei sistemi biologici, essi hanno bisogno di una funzionalizzazione che può migliorarne la solubilità e la biocompatibilità e che, attraverso l'incorporazione di vari agenti bioattivi può fornire un valido aiuto nella rigenerazione nervosa.

Mattson et al. 154 hanno riportato la prima applicazione di nanotubi di carbonio a parete multipla nella ricerca delle neuroscienze; essi hanno confermato l'efficacia dell'utilizzo di nanotubi come substrati per la crescita neuronale e sottolineato l'importanza di una loro funzionalizzazione con un composto bioattivo (4- idrossinonenale), come supporto ulteriore alla rigenerazione tissutale.

Matsumoto et al. 155 hanno riportato il primo studio sulla crescita dei neuriti di neuroni dei gangli delle radici dorsali di pulcino, utilizzando nanotubi di carbonio rivestiti con Nerve growth factor (NGF) e il Brain Derived Growth Factor (BDNF).

Questo studio ha rivelato che i nanotubi di carbonio rivestiti con neurotrofine sono in grado di stimolare la crescita dei neuriti di queste cellule nervose.

A dispetto di tali caratteristiche interessanti, la tossicità dei nanotubi di carbonio rappresenta, ad oggi, una delle preoccupazioni principali, con diversi gruppi di ricerca che ne sottolineano la somiglianza alle fibre di amianto 156.

Pertanto, nonostante il grande potenziale dei CNT e le loro proprietà favorevoli, bisogna sottolineare la necessità di una loro funzionalizzazione per l'impiego nei sistemi biologici che, oltre ad incrementarne l'efficacia ne ridurrebbe la tossicità ma, ovviamente, fino a che questi dati, specialmente quelli relativi alla tossicità, non vengono analizzati da un'abbondante serie di studi, non è possibile valutare il loro impiego in ambito clinico.

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3.1.2GUIDA PER CONTATTO E SUPERFICI NANOSTRUTTURATE

Harrison, 100 anni fa, dimostrava che le cellule potevano essere influenzate in vitro da opportuni segnali fisici. I neuroni da lui messi a coltura crescevano infatti se coltivati a contatto con fili di ragnatela seguendone l’orientamento 157

.Nel 1945 il neurobiologo americano Weiss denominò questo comportamento “guida-per- contatto”, identificato in seguito come uno dei modi con i quali le cellule sono in grado di assumere un orientamento e migrare 158.

Nel corpo, le cellule incontrano un complesso ambiente di segnali, tra cui indicazioni topografiche e quindi squisitamente “fisiche” provenienti dall'ambiente extracellulare. Una topografia imposta può influenzare il comportamento cellulare sulle superfici attraverso la regolazione dell' adesione, dell'allineamento, della morfologia, e perfino dell' espressione genica. In particolare, la risposta delle cellule nervose alla topografia è complessa, e dipende dalle dimensioni, dalla morfologia e dalle caratteristiche fisiche intrinseche del substrato.

Negli ultimi trenta anni il comportamento cellulare in rapporto alla topografia delle superfici è stato studiato in modo approfondito.

I “segnali topografici” indagati sono stati: superfici curve, gradini singoli, piani angolati, ostacoli verticali, avvallamenti, pori, cilindri, sfere, anche se le forme più studiate sono stati i segnali anisotropi costituiti da una serie di solchi e creste parallele 159,160.

I neuroni, sfruttando la guida-per-contatto, sono in grado di recepire, codificare e seguire gli stimoli topografici che le strutture di supporto offrono loro, stimoli fondamentali per garantire un’adeguata connettività nervosa.

Ad esempio, durante l' istogenesi della corteccia cerebrale, i neuroni corticali scorrono lungo le cellule gliali disposte secondo un preciso assetto geometrico

161,162

. Un comportamento analogo è riscontrabile durante la migrazione dei neuroblasti del cervelletto anche in specie filogeneticamente più antiche come la Drosophila 163,164.

L' orientamento per contatto, inoltre, sembra giocare un ruolo nella risposta al danno sia nel sistema nervoso periferico che centrale. E' stato riconosciuto da

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tempo che le cellule di Schwann (SC) sono di aiuto nella riparazione del danno nervoso. Infatti, in risposta a un'interruzione assonica, le SC proliferano, formando le cosiddette bande di Büngner, che costituiscono le tracce che verranno poi seguite al momento della reinnervazione. Gli assoni rigeneranti e le SC hanno una interrelazione complessa, che comprende la direzione e la fornitura di molteplici spunti di orientamento da parte delle SC. Le bande di Büngner svolgono un ruolo importante in questo processo, come guida dei nervi periferici rigeneranti.

Nell’ambito della rigenerazione delle lesioni nervose (sia centrali che periferiche) sforzi sono stati compiuti nel realizzare degli scaffold con determinate caratteristiche topografiche in grado di “dialogare” direttamente con le cellule (nervose e gliari) al fine di supportare ed incentivare la rigenerazione.

Dato che le componenti dei tessuti su scala molecolare hanno le dimensioni dei nanometri e che le cellule interagiscono direttamente con una matrice extracellulare nanostrutturata, la strutturazione dei supporti per la crescita nervosa realizzata con dimensioni dei nano/micrometri può giocare un ruolo chiave durante i processi rigenerativi, mimando i fisiologici segnali topografici nanometrici che ricevono le cellule nervose durante lo sviluppo e la rigenerazione.

La topografia dello scaffold, indipendentemente dal materiale utilizzato, è in grado di modulare: l’adesione, l’allineamento, la migrazione, la velocità e la differenziazione controllata di diversi tipi cellulari. Molti esperimenti hanno messo in luce come la topografia di una superficiale di dimensioni sub-micrometriche possa influenzare la crescita neuronale e la funzionalità delle cellule.

I nanomateriali disponibili presentano svariate tipologie di segnali topografici: coni, superfici sferiche, fibre, solchi, creste, etc., e possono essere prodotti con diverse tecnologie di fabbricazione (fotolitografia, Electron Beam Lithography, Electrospinning, Self Assembly, etc).

Uno scaffold biologicamente compatibile dovrebbe fornire un supporto adeguato per la crescita cellulare, la sopravvivenza e la differenziazione.

Esso dovrebbe presentare un tasso controllato di biodegradazione, promuovere interazioni cellula-substrato, l'integrazione con l'ambiente in vivo, ed essere

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compatibile con le condizioni fisiologiche senza causare citotossicità o una risposta immunitaria.

I nanomateriali sembrano rispondere a molti di questi requisiti e caratteristicamente questi prodotti offrono un’enorme superficie in grado d’interagire con le cellule aumentando quindi le possibilità di interazione tra scaffold e tessuto.

La versatilità con cui possono essere prodotte queste superfici e la loro possibile funzionalizzazione con molecole biologiche (peptidi/proteine, fattori di crescita, etc.) può offrire in futuro l’opportunità di realizzare scaffold in grado di interagire con specifiche funzioni cellulari 165.

Negli ultimi 20 anni sono stati realizzati diversi studi basati sul concetto della guida-per-contatto, e sono stati prodotti vari tipi di scaffold nanostrutturati.

Un esempio sono i substrati anisotropi che presentano intervalli di creste e di solchi alternati disposti parallelamente. Sono definiti anisotropi quei materiali le cui caratteristiche dipendono dalla direzione lungo la quale vengono utilizzati. Studi condotti su substrati strutturati con micro-scanalature indicano che la risposta delle cellule a questa topografia si traduce in un progressivo allineamento in relazione al progressivo aumento della profondità della scanalatura da 0,2 a 4 µm, mentre l’effetto diminuisce qualora le dimensioni dell’incavo siano minori di 200 nm 166–168.

Questi studi suggeriscono che la topografia dei substrati può essere personalizzata al fine di controllare i vari comportamenti cellulari quali la direzione, la ramificazione o l’allungamento dell’assone.

I substrati anisotropi hanno anche effetti sulla motilità delle cellule di Schwann (SC).

Lo studio delle SC è stato preso in considerazione in un recente lavoro di Mitchel ed Hoffman-Kim, che hanno studiato in vitro la motilità delle SC in risposta a diversi segnali tipografici dati dalla superficie di supporto. Gli Autori hanno coltivato le SC su superfici lisce e su superfici con topografia anisotropa (creste e valli con periodo 30/60 µm) andando poi a valutare la diversa motilità, l’allineamento e la velocità del movimento cellulare. Essi riportano la tendenza da

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parte delle SC a risentire della topografia del substrato allineandosi preferibilmente lungo l’asse del segnale topografico con delle variazioni legate alle dimensioni dei solchi e delle creste. Le cellule coltivate invece su superfici lisce presentavano un orientamento random sul substrato 169.

Come le superfici con alternanza di creste e scanalature, così anche i substrati con fibre allineate presentano una topografia anisotropa alle cellule sia in vitro che in vivo. Poiché l'allineamento è un obiettivo così importante per il tessuto neurale, un certo numero di studi sono stati condotti negli ultimi anni per valutare il comportamento delle cellule staminali neuronali primarie, dei neuroni e delle cellule gliali su fibre allineate.

Per la fabbricazione delle fibre allineate nanometriche viene utilizzata una tecnica particolare detta “Elettrospinning” e possono essere impiegati materiali diversi: 1) materiali sintetici biocompatibili, come il poli (acido glicolico) (PGA), poli(L- acido lattico) (PLLA), poli (caprolattone) (PCL), poli (3-idrossibutirrato) (PHB) e loro copolimeri, 2) materiali naturali, come collagene, gelatina, laminina e chitosano, e 3) materiali biosintetici ottenuti attraverso la miscelazione di polimeri sintetici e naturali, la formazione di legami covalenti o l'adsorbimento superficiale. Rispetto alle fibre orientate casualmente, le fibre allineate sono maggiormente in grado di promuovere la crescita dei neuriti. Nello studio condotto da Patel et al., le cellule DRG, coltivate su nanofibre in PLLA orientate in maniera random, non hanno mostrato alcuna crescita dei neuriti dopo 6 giorni. In contrasto, una rilevante estensione dei neuriti da espianti DRG è stata osservata su fibre allineate 170. Inoltre, molti studi hanno dimostrato che i neuroni coltivati su fibre allineate hanno neuriti più lunghi di quelli coltivati sulle fibre casuali 171–173.

Le nanofibre allineate offrono infatti una guida per le cellule in rigenerazione di più semplice lettura e più facile da seguire se confrontata con i substrati formati da fibre disposte in modo casuale.

La possibilità di ottenere la migrazione delle cellule di Schwann su nanofibre elettrofilate allineate è stata studiata in vitro da Schnell et al 171.

I dati dimostrano che le fibre elettrofilate composte da una lega in PCL/ collagene rappresentano un substrato adatto per sostenere la proliferazione cellulare, la

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formazione di processi e la migrazione delle cellule di Schwann e come tale sarebbe un buon materiale per la fabbricazione di impianti nervosi artificiali.

Sebbene gli scaffold fibrosi allineati possano indurre un più evidente allineamento delle cellule, anche i substrati con fibre orientate in maniera casuale possono fornire una guida per contatto in una certa misura, infatti le cellule possono allungare il loro citoscheletro su fibre multiple e seguire l'orientamento delle fibre. Al fine di valutare l'efficacia di tali scaffold nella rigenerazione dei nervi e nel recupero funzionale, diversi studi in vivo sono stati condotti. Questi studi hanno utilizzato le nanofibre su lesioni di nervo sciatico di ratto con un gap nervoso in alcuni casi di 10 mm, in altri di 15 mm. Le conclusioni tratte in vivo, anche se non definitive, sono diverse: i neuriti crescono lungo l'asse longitudinale dei condotti contenenti nanofibre e tali condotti permettono un miglior recupero funzionale rispetto ai nervi non trattati 174; i costrutti fibrosi allineati sono in grado di fornire un “orientamento per contatto”, di massimizzare le indicazioni direzionali topografiche e di fornire prestazioni paragonabili agli autotrapianti nel ridurre i deficit funzionali dopo la lesione del nervo 175; nei condotti con nanofibre allineate è stato riscontrato un più alto numero totale di assoni mielinizzati e una più spessa guaina mielinica rispetto a quelli con microfibre e a quelli vuoti 176.

La conclusione definitiva che le fibre allineate nella riparazione dei nervi possano migliorare in vivo la guida per contatto e l'adesione cellulare non può essere derivata fino a che ulteriori studi non vengano eseguiti. Inoltre sarebbe utile uniformare i modelli sperimentali utilizzati in modo da ottenere risultati più concreti e confrontabili.