3.1. Popolazione oggetto dello studio
Per il nostro lavoro di ricerca l’analisi di metilazione del gene MTHFR è stata effettuata su campioni di placche aterosclerotiche carotidee e su leucociti di sangue periferico di 47 pazienti sottoposti ad endoarteriectomia carotidea. I livelli di metilazione dei leucociti di sangue periferico dei pazienti sono stati confrontati con quelli di 58 soggetti sani (Tabella 1).
In entrambi i gruppi è stata eseguita l’analisi del polimorfismo MTHFR C677T.
Sia per i pazienti che per i controlli sono noti i livelli ematici di omocisteina, mentre per il gruppo dei pazienti sono state fornite informazioni riguardanti l’abitudine al fumo. I pazienti sono stati reclutati presso il DAI Cardio Toracico Vascolare dell’ Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana (AOUP) mentre i controlli sono stati reclutati presso il DAI di Neurologia dell’AOUP.
Lo studio è stato effettuato in accordo con la Dichiarazione di Helsinki e per ogni soggetto è stato raccolto un consenso informato.
Analisi di metilazione P-value Pazienti (N= 47) Controlli (N= 58) Età media (media ± dv) 72.47.7 74.78.5 0.16 Genere Femmine Maschi 11 (23%) 36 (77%) 19 (33%) 39 (67%) 0.29 Hcy media (media ± ds) 16,9±7,9 14,3±7,8 0.04 Abitudine al fumo Fumatori Ex fumatori Non fumatori 12 (25,5%) 20 (42,5%) 15 (32%) N.D. ---
3.2. Estrazione del DNA genomico
L’estrazione del DNA genomico è stata effettuata da campioni di placca aterosclerotica carotidea e da campioni di sangue periferico utilizzando il kit di estrazione “QIAmp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit”.
Il DNA estratto è stato successivamente quantificato usando il Nano Drop ND 2000c (NanoDrop Thermo scientific, Wilmington, DE), strumento che esegue letture spettrofotometriche a 230 nm, 260 nm e 280 nm, picchi d’assorbanza rispettivamente di carboidrati e composti aromatici, acidi nucleici e proteine.
La lettura con il Nano Drop viene effettuata al fine di quantificare il DNA estratto dai campioni e per valutarne la purezza.
3.3. Genotipizzazione: MTHFR C677T
La genotipizzazione di MTHFR C677T è stata effettuata tramite la tecnica della PCR- RFLP.
Tutti i prodotti della digestione sono stati analizzati tramite elettroforesi in gel di agarosio al 3%, contenente Bromuro di Etidio.
Per l’analisi del polimorfismo MTHFR C677T viene amplificato un frammento di 198 bp usando 10 pmoli di ciascuno dei seguenti primers:
− Forward: 5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3’ − Reverse: 5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’,
1.25 unità di Taq DNA polimerasi (INVITROGEN, Milano, Italia), 0.1 mM di ciascun dNTP, 1.5 mM di MgCl2, Buffer 1X (Invitrogen) e 30/40 ng di DNA genomico in un volume finale di 25 μl.
Le reazioni di PCR prevedevano un’iniziale denaturazione di 2 minuti a 94°C seguita da 40 cicli di 30 secondi a 94°C (fase di denaturazione), 30 secondi a 62°C (fase di annealing), 30 secondi a 72°C (fase di allungamento), seguiti da un’estensione finale di 7 minuti a 72°C.
La digestione è stata effettuata overnight con l’enzima di restrizione HinfI (FERMENTAS, Milano, Italia); la sostituzione di una C con una T determina la comparsa di un sito di restrizione. In presenza dell’allele 677T si ottengono due frammenti uno di 175 bp ed uno di 23 bp; mentre in presenza dell’allele 677C si osserverà un prodotto non digerito di 198 bp; solo i frammenti di 198 bp e 175 bp sono visibili nel gel di agarosio. L’elettroforesi mostra pattern diversi a seconda che il soggetto avesse un genotipo wild-type, eterozigote o omozigote mutato. Gli individui omozigoti wild-type presentano un frammento di 198 bp corrispondente al prodotto di PCR non digerito; gli individui omozigoti mutati sono caratterizzati da una banda corrispondente ad un frammento di 175 bp, mentre gli individui eterozigoti presentano due bande sul gel di agarosio corrispondenti ad un frammento di 198 bp (allele 677C) ed uno di 175 bp (allele 677T) (Figura 8).
3.4. Analisi di metilazione
Per l’analisi di metilazione il DNA dopo essere stato estratto, dai campioni di placca aterosclerotica carotidea e da leucociti periferici, è stato quantificato e trattato con il sodio bisolfito.
Vengono trattati circa 200 ng di DNA usando il kit “EpiTect Bisulfite Kit” (Qiagen, Milano, Italia) seguendo il protocollo fornito dalla ditta.
Il trattamento con il bisolfito prevede la modificazione delle citosine non metilate in uracile mentre le 5-metilcitosine resistono alla modificazione.
La metilazione delle citosine avviene di solito all’interno di regioni specifiche definite isole CpG. Sono spesso regioni regolatorie presenti all’interno dei promotori dei geni. Il trattamento con il bisolfito permette in tal modo di conservare l’informazione epigenetica del DNA.
In ogni esperimento è stato incluso del DNA standard con note percentuali di metilazione (0%, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%) utilizzato come riferimento per lo studio di metilazione dei campioni di DNA estratti dalla placca aterosclerotica e dai leucociti periferici.
Il termociclatore utilizzato è il C1000™ Thermal Cycler supportato dal CFX 96™ Real- Time (Bio-Rad).
3.5. Protocollo MS-HRM
Per l’analisi di metilazione del gene MTHFR è stato amplificato un frammento del primo esone di 155 pb comprendente 7 dinucleotidi CpG utilizzando i seguenti primers:
Forward: 5’-TTTTAATTTTTGTTTGGAGGGTAGT -3’
Reverse: 5’-AAAAAAACCACTTATCACCAAATTC-3’
La reazione è stata eseguita in un volume di 25 μl contenente:
− 12,5 μl of master mix (Qiagen, Milan, Italy) − 1 μl di ciascun primer
− 1 μl di DNA trattato con bisolfito − 9.5 μl di acqua.
Ciascuna reazione è stata eseguita in duplicato. Le condizioni di PCR prevedevano: 1 ciclo di 95°C per 12 min; 60 cicli di tre step: 95°C per 30 s, 54 °C per 45 s, e 72°C per 30s; subito dopo la reazione di amplificazione i campioni sono stati sottoposti a denaturazione (95°C per 10 s); dopo di che la temperatura viene abbassata a 50°C per 1 min per permettere ai prodotti di PCR di ibridizzare. A questo punto viene incrementata la temperatura per l’acquisizione del melting; l’incremento della temperatura per l’analisi di melting è stato di 0,2°C ogni 15 secondi per un range di temperatura compreso tra 65 e 95°C.
3.6. Analisi statistica
L’analisi multifattoriale della varianza (MANOVA) è stata utilizzata per valutare la possibile differenza dei livelli ematici di hcy tra pazienti e controlli, includendo come covariate età, genere, polimorfismo MTHFR C677T, e per confrontare i livelli di metilazione di MTHFR tra i due gruppi includendo come covariate età, genere, polimorfismo MTHFR C677T e Ln hcy.
Lo stesso tipo di test è stato utilizzato per valutare l’effetto dei fattori di rischio, polimorfismo del gene MTHFR C677T, livelli ematici di hcy e abitudine al fumo, sui livelli di metilazione del primo esone del gene MTHFR utilizzando come covariate età e genere.
L’analisi della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per valutare l’effetto del genere sui livelli di metilazione mentre un test T per dati appaiati è stato utilizzato per confrontare i livelli di metilazione tra tessuti aterosclerotici e leucociti di sangue periferico.
L’analisi di regressione lineare è stata utilizzata per ricercare sia la correlazione tra l’età e i livelli ematici di hcy, che la correlazione tra metilazione del gene nei tessuti aterosclerotici e in leucociti di sangue periferico.
Dal momento che la concentrazione di hcy non mostrava una distribuzione lineare, tale dato biochimico è stato sottoposto a trasformazione logaritmica prima di ciascuna analisi.
L’analisi è stata realizzata usando STARTGRAPHICS 5.1 Plus software package per Windows.
4. RISULTATI
4.1. Confronto dei livelli di metilazione di MTHFR tra tessuti aterosclerotici e leucociti di sangue periferico
Confrontando i livelli di metilazione del gene MTHFR tra campioni di tessuti aterosclerotici e leucociti di sangue periferico, utilizzando un test T per dati appaiati, abbiamo osservato che mediamente la metilazione dei tessuti aterosclerotici era significativamente più bassa (17.6%8.1) rispetto a quella dei leucociti di sangue periferico (30.4%5.2) (P-value<0.001) (Figure 9A-9B) (Tabella 2).
Tabella 2: Livelli di metilazione del gene MTHFR in placche aterosclerotiche e leucociti di sangue periferico.
A.
Figura 9A: curve di melting del gene MTHFR: standards e campioni di leucociti di sangue periferico e tessuti aterosclerotici.
TOTALE
N=47 Metilazione MTHFR (%) P-value
Tessuti aterosclerotici 17.6% ±8.1
<0.001
B.
4.2. Correlazione tra i livelli di metilazione di tessuti aterosclerotici e di leucociti di sangue periferico
Non abbiamo trovato una relazione statisticamente significativa della metilazione del gene MTHFR tra tessuti aterosclerotici e leucociti di sangue periferico (P-value=0.20). Tuttavia, il coefficiente di correlazione (r) essendo uguale a 0,19 indica una relazione relativamente debole tra le variabili (Figura 10).
Figura 10: correlazione tra la metilazione di MTHFR tra tessuto aterosclerotico e leucociti periferici.
4.3. Confronto dei livelli ematici di hcy tra pazienti e controlli
Dal confronto dei livelli ematici di hcy tra il gruppo dei pazienti (16.9 μmol/L 7.9) e il gruppo dei controlli (14.3 μmol/L 7.8) è stato osservato che i livelli di hcy erano significativamente più alti nel gruppo dei pazienti (P-value=0.008) (Figura 11) (Tabella 3).
Tra le varie covariate prese in esame (età, genere, polimorfismo MTHFR C677T) abbiamo osservato che il fattore età ha un effetto statisticamente significativo sui livelli di hcy (P-value<0.001) (MANOVA: età, genere, MTHFR C677T).
Controlli
N=58
Pazienti
N=47 p-value
Livelli di hcy
(media d.s.) 14.3 μmol/L 7.8 16.9 μmol/L 7.9 0.008 Tabella 3:Valori di hcy in pazienti e controlli.
4.4. Età e livelli ematici di hcy
Nella popolazione generale del nostro studio un’associazione statisticamente significativa è stata osservata tra i livelli ematici di hcy e l’età. In particolare, abbiamo notato un aumento dei livelli ematici di hcy con il progredire dell’età (P-value=0.0001) (Figura 12).
4.5. Metilazione del gene MTHFR in pazienti e controlli
Valutando i livelli di metilazione del gene MTHFR in leucociti di sangue periferico abbiamo trovato una differenza statisticamente significativa tra il gruppo dei pazienti e il gruppo dei controlli (P-value=0.02). I pazienti mostravano più bassi livelli di metilazione (30.4%5.2) rispetto ai controlli (34,9%12.3) (Figura 13A–13B) (Tabella 4).
Tra le covariate prese in esame (età, genere, MTHFR C677T e Ln[hcy]) abbiamo osservato che il genere ha un effetto statisticamente significativo (P-value=0.0001).
Tabella 4: Livelli di metilazione del gene MTHFR in pazienti e controlli.
A.
Figura 13A: curve di melting del gene MTHFR: standards e campioni di pazienti e controlli.
Controlli N=58 Pazienti N=47 P-value Metilazione MTHFR leucociti periferici (media d.s.) 34,9%12.3 30.4%5.2 0.02
B.
Figura 13B: confronto dei livelli di metilazione del gene MTHFR in leucociti di sangue periferico tra pazienti e controlli.
4.6. Polimorfismo MTHFR C677T, livelli ematici di hcy e metilazione del gene
MTHFR
Nella popolazione generale oggetto del nostro studio abbiamo osservato che gli omozigoti per l’allele MTHFR 677T mostravano una tendenza ad avere dei livelli più alti di hcy anche se rispetto agli altri due genotipi, MTHFR 677CT e MTHFR 677CC, non c’era una differenza statisticamente significativa (P-value=0.21) (Tabella 2) (Figura 14). Correlando i livelli di metilazione del gene MTHFR di leucociti di sangue periferico con i genotipi del polimorfismo MTHFR C677T, abbiamo anche osservato che i pazienti omozigoti mutati 677TT mostravano dei livelli di metilazione, seppur non significativi, tendenzialmente più bassi (28%5.1) rispetto ai genotipi 677CT (31.1%5.8) e 677CC (31.5%4) (P-value=0.26) (Figura 15).
Correlando i livelli di metilazione del gene MTHFR in tessuti aterosclerotici con i genotipi del polimorfismo MTHFR C677T non abbiamo trovato alcuna differenza (P-value=0.92) (Figura 16).
I dati sono stati ottenuti utilizzando una MANOVA corretta per età e genere.
Tabella 5: genotipi di MTHFR C677T e rispettivi livelli di hcy.
TOTALE Hcy (mediad.s) P-value
MTHFR C677T 105 15.58 0.21 CC Wild-type 34 (32.4%) 14.65.1 CT Eterozigote 53 (50.5%) 14.97.1 TT Mutato 18 (17.1%) 2013
Figura 14: correlazione del Ln[hcy] con i genotipi del polimorfismo MTHFR C677T. MTHFR C677T TOTALE=47 P-value CC N=13 CT N=25 TT N=9 Metilazione MTHFR leucociti periferici 31.5% ±4 31.1% 5.8 28% ±5.1 0.26 Metilazione MTHFR tessuti aterosclerotici 18.2% ±7.7 17.7% 10.1 16.7% ±4 0.92
Figura 15: correlazione tra metilazione del gene MTHFR in leucociti di sangue periferico e genotipi del polimorfismo MTHFR C677T in pazienti.
Figura 16: correlazione tra metilazione del gene MTHFR in tessuti aterosclerotici e genotipi del polimorfismo MTHFR C677T in pazienti.
4.7. Correlazione tra hcy e livelli di metilazione del gene MTHFR
I pazienti sono stati stratificati in due gruppi: pazienti con livelli fisiologici di hcy (<15 μmol/L) e pazienti con iperomocisteinemia (>15 μmol/L). Nessuno dei nostri pazienti aveva iperomocisteinemia severa. Il 38.3% aveva iperomocisteinemia moderata, mentre il 10.6% presentava iperomocisteinemia intermedia.
Livelli di hcy >15 μmol/L correlavano con livelli di metilazione di MTHFR più bassi in tessuti aterosclerotici (P-value=0.05) (Figura 17A).
Una correlazione, seppur non significativa, è stata osservata anche per la metilazione di MTHFR in leucociti di sangue periferico (P-value=0.11) (Figura 17B).
(MANOVA corretta per età e genere).
Tabella 7: Livelli di metilazione del gene MTHFR nel gruppo dei pazienti confrontati con i livelli di hcy.
A. TOTALE N=47 Hcy <15 N=24 (51.1%) Hcy >15 N=23 (48.9%) P-value Metilazione MTHFR
Leucociti di sangue periferico 31.5% ±5.1 29.3% 5.2 0.11 Metilazione MTHFR
B.
Figure 17A-17B: correlazione livelli ematici di hcy e metilazione di MTHFR in tessuti aterosclerotici (A) e in leucociti periferici (B).
4.8. Correlazione tra la metilazione del gene MTHFR e il genere
Una correlazione statisticamente significativa è stata trovata tra lo stato di metilazione del gene MTHFR ed il genere a livello della popolazione generale e nel gruppo dei controlli. In particolare le donne mostrano più alti livelli di metilazione rispetto agli uomini (Tabella 8) (Figura 18A-18B) (P-value=0.0001) (P-value=0.01). Nel gruppo dei pazienti tale correlazione non è risultata statisticamente significativa (P-value=0.7) (Figura 18C).
Tabella 8: Livelli di metilazione di MTHFR in maschi e femmine della popolazione generale.
A.
Figura 18A: correlazione tra i livelli di metilazione del gene MTHFR e il genere nella popolazione generale.
TOTALE
N=105
Metilazione MTHFR
leucociti di sangue periferico P-value Maschi
N=75 (71.4%) 30.4% ±9.2
<0.001
Femmine
B.
Figura 18B: correlazione tra i livelli di metilazione del gene MTHFR e il genere nel gruppo dei controlli.
C.
4.9. Abitudine al fumo e correlazione con i livelli di metilazione del gene MTHFR
I pazienti sono stati stratificati in base all’abitudine al fumo in: fumatori, ex-fumatori e non fumatori (Tabella 9). Utilizzando una MANOVA corretta per età e genere abbiamo osservato che i fumatori avevano delle percentuali di metilazione più alte rispetto agli ex-fumatori e ai non fumatori. Una differenza statisticamente significativa dei livelli di metilazione in leucociti di sangue periferico è stata trovata tra fumatori e non fumatori (P-value<0.05) (Figura 19). Nessuna differenza statisticamente significativa dei livelli di metilazione è stata osservata in tessuti aterosclerotici tra i tre gruppi (P-value=0.45).
Tabella 9: abitudine al fumo e metilazione di MTHFR.
Figura 19: correlazione tra l’abitudine al fumo e la metilazione di MTHFR in leucociti di sangue periferico.
Abitudine al fumo
N= 47
Metilazione MTHFR in leucociti di sangue periferico
(media d.s) P-value Fumatori N=12 32.6±4.3 0.13 Ex-fumatori N=20 30.5±5.4 Non fumatori N=15 28.8±5.3
4.10. Effetti dell’abitudine al fumo e dei livelli di hcy sulla metilazione del gene
MTHFR
Per valutare l’effetto dei fattori di rischio, fumo e livelli ematici di hcy, sulla metilazione del gene MTHFR abbiamo stratificato la popolazione dei pazienti in base all’abitudine al fumo e ai livelli di hcy utilizzando come cut-off 15 µmol/L (Figura 20).
Utilizzando una MANOVA corretta per età e genere è stato osservato che i livelli di metilazione di MTHFR in leucociti di sangue periferico sono significativamente più alti in fumatori con livelli di hcy <15 µmol/L rispetto ad individui non fumatori con livelli di hcy >15 µmol/L (P-value=0.008) (Figura 21).
Figura 21: correlazione tra metilazione del gene MTHFR e pazienti fumatori con livelli di hcy <15 µmol/L e non fumatori con livelli di hcy >15 µmol/L.