Nel nostro studio prospettico abbiamo incluso pazienti canini con diagnosi di enteropatia cronica primaria presentati presso l’Ospedale Didattico Veterinario “M. Modenato” dell’Università di Pisa, nel periodo compreso tra gennaio 2016 e marzo 2017.
I cani inclusi dovevano aver fatto un percorso completo per una diagnosi di enteropatia primaria comprensivo di:
- segnalamento e anamnesi, con particolare attenzione alla segnalazione di vomito, diarrea, nausea, scialorrea, abbattimento, disappetenza, poliuria/polidipsia, melena, costipazione, tenesmo, borborigmi e flatulenze
- visita clinica
- profilo emato-biochimico completo - una ecografia addominale
Abbiamo escluso i pazienti che presentavano una sintomatologia acuta e quelli con enteropatie secondarie.
Di ogni paziente incluso nello studio abbiamo valutato: 1. Le caratteristiche delle feci, in particolare:
a. la presenza di sangue e/o muco b. la frequenza di defecazione
c. il Fecal Score Index al momento dell’inclusione con l’ausilio di una tabella illustrata che ci ha permesso di assegnare ai campioni fecali un diverso punteggio in una scala da 1 a 7 (Nestlé PURINA, Société des Produits Nestlé S.A., Vevey, Switzerland.)
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2. L’index clinico di gravità, valutato utilizzando il CCECAI (chronic enteropathy clinical activity index), un nuovo score proposto da Allenspach et al. (2007) applicabile a tutti i cani con enteropatie croniche.
Nello score CCECAI i parametri presi in considerazione, che abbiamo estrapolato dall’anamnesi del soggetto e dagli esami ematobiochimici, sono i seguenti: attitudine/attività, appetito, vomito, consistenza delle feci, frequenza di defecazione, perdita di peso, concentrazione delle albumine, ascite ed edema periferico, prurito.
Per ognuna di queste caratteristiche è stato assegnato un punteggio e, alla fine, sommando i vari punteggi si ottiene lo score finale che permette di identificare l’enteropatia come clinicamente insignificante, lieve, moderata o grave.
58 da: Washabau RJ, Day MJ., Canine and Feline Gastroenterology. Elsevier Saunders, 2013
3. L’inquadramento retrospettivo del tipo di enteropatia, considerando le FRE, ARE e IRE. 76
Per FRE si intende una enteropatia responsiva al solo cambiamento della dieta, colpisce maggiormente cani più giovani e il trattamento richiede l’utilizzo di una dieta ad esclusione. L’ARE è un tipo di enteropatia responsiva agli antibiotici, viene diagnosticata quando c’è risposta clinica al trattamento con antibiotici, le recidive si ripresentano con la sospensione del trattamento e non viene identificata nessun’altra eziologia sottostante. Il termine IRE, infine, si usa per descrivere pazienti affetti da segni gastroenterici persistenti o ricorrenti, che hanno una
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evidenza istopatologica di infiammazione intestinale e sono state escluse tutte le possibili cause di questa condizione.
Abbiamo anche differenziato tra enteropatie proteino-disperdenti e quelle, invece, non proteino – disperdenti, facendo riferimento ai valori dell’albumina nel profilo biochimico del soggetto.
4. Esame coprologico
I campioni fecali, raccolti in giornata, venivano suddivisi in due aliquote, una destinata al Laboratorio di Patologia Clinica dell’Ospedale Didattico e una destinata alla Sezione di Parassitologia del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa.
Presso il laboratorio dell’ODV sono state effettuate le seguenti procedure: - Flottazione con soluzione satura di NaCl
- Kit ELISA IDEXX SNAP® Giardia (IDEXX Laboratories)
Il kit è costituito da un dispositivo coniugato/tampone contenente 0,7 ml di coniugato anti-
Giardia/perossidasi (contiene anche gentamicina e Kathon come conservante) e da dispositivo SNAP
contenente 0,6 ml di soluzione substrato e 0,4 ml di soluzione di lavaggio. Tutti i componenti devono essere portati a temperatura ambiente (18–25°C) prima dell'esecuzione dell'analisi.
Le feci possono essere impiegate fresche, precedentemente congelate o conservate a temperature comprese fra 2–8°C per un massimo di 7 giorni. I campioni fecali devono però trovarsi a temperatura ambiente (18–25°C) prima di iniziare la procedura di analisi.
Il test è stato eseguito seguendo la procedura qui di seguito:
1. Servendosi del tampone, rivestirne la punta di un leggero strato di feci.
2. Rompere lo stelo di plastica della valvola all'interno del bulbo del reagente piegando il dispositivo in corrispondenza del collo. Comprimere e rilasciare il bulbo tre volte per far passare la soluzione di coniugato nel bulbo attraverso la punta del tampone.
3. Disporre il dispositivo SNAP su una superficie piana. Usando il tampone/bulbo come se fosse una pipetta, trasferire 5 gocce della soluzione campione/coniugato nel pozzetto del campione del dispositivo SNAP. Il campione fluisce attraverso la finestra dei risultati, raggiungendo il cerchio di attivazione in circa 30–60 secondi. Appena il campione appare nel cerchio di attivazione, premere con fermezza verso il basso l'attivatore fino a quando non resta a filo con il corpo del dispositivo.
4. Attendere 8 minuti per leggere il risultato dell'analisi tramite le macchie di reazione nella finestra dei risultati:
60 il campione è NEGATIVO se non c'è colore nella macchia del campione e nella macchia del controllo negativo o il colore della macchia del campione è uguale al colore della macchia del controllo negativo.
Il campione è POSITIVO se il colore della macchia del campione è più scuro rispetto al colore della macchia del controllo negativo.
Presso il laboratorio di coprologia della Sezione Parassitologia abbiamo effettuato sullo stesso campione fecale (conservato a 4° C) le seguenti procedure:
- Flottazione con soluzione di NaCl
- Kit ELISA RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi (R-Biopharm) - Test di Baermann
La soluzione flottante è stata preparata con 500 gr di NaCl + 1388 gr di acqua distillata, portata ad ebollizione fino a che il sale non forma un gel trasparente sul fondo della beuta e lasciata poi raffreddare.
Il kit utilizzato in questo caso è stato il RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi
(R-Biopharm) in cassette o strisce; si tratta di un test rapido immunocromatografico
per la rilevazione qualitativa di Cryptosporidium parvum e/o Giardia duodenalis in campioni fecali. Risulta avere una sensibilità del 100% rispetto alla microscopia convenzionale e una specificità del 95,2%. ( www.r-biopharm.de - R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany).
Il presente test rapido è un test Lateral-Flow immunocromatografico monofase, nel quale anticorpi specifici mirati contro entrambi i rispettivi parassiti sono accoppiati a particelle di lattice rosse (Giardia specifici) o blu (Cryptosporidium specifici). Altri anticorpi specifici contro entrambi gli agenti patogeni sono saldamente fissati alla membrana.
61 Prima dell'utilizzo portare campioni, tampone di estrazione e strisce per test a temperatura ambiente (20–25 °C).
Il test è stato eseguito secondo la seguente procedura:
- introdurre in una provetta graduata 1 ml di tampone di estrazione Diluent, contenente 0, 1% di azoturo di sodio.
- sospendere 50 mg del campione nel tampone di estrazione e quindi omogeneizzare bene. L'omogeneizzazione avviene per introduzione ed espulsione ripetuta della sospensione mediante una pipetta monocanale in dotazione.
- lasciare quindi sedimentare la sospensione omogeneizzata per almeno 3 minuti finché non si forma un supernatante chiaro.
- nel caso delle strisce, immergere la Strip nel supernatante senza superare l’indicatore contrassegnato dalla freccia, nel caso della cassetta, introdurre mediante la pipetta 4 gocce di supernatante chiaro nell’apertura di inserimento rotonda della cassetta stessa.
- Il risultato del test può essere letto dopo 5 minuti.
Devono apparire un massimo di tre bande, una banda blu per Cryptosporidium, una rossa per Giardia e una verde ( = banda di controllo). Se manca la banda di controllo verde, il test non è valutabile e non è considerato valido.
Se è il test è positivo per Giardia sono visibili le bande rossa e verde. L’intensità della colorazione è variabile e dipenderà dalla quantità di antigene presente nel campione.
Se è Negativo è visibile solo la banda verde di controllo.
Il test di Baermann è stato eseguito soprattutto per escludere la presenza di infestazioni parassitarie a livello polmonare, sostenute da parassiti il cui ciclo prevede la presenza di larve nelle feci (metastrongili respiratori e Strongyloides stercoralis).
Questa metodica sfrutta la spiccata idrofilia e la mobilità spontanea delle larve di nematodi. L’apparato di Baermann è costituito da un imbuto collegato tramite un tubo di gomma ad una provetta. L’imbuto è riempito d’acqua per circa ¾ e il campione di feci (circa 3-4gr) viene posizionato su un setaccio a livello del collo largo dell’imbuto. L’apparecchiatura è lasciata per una notte a temperatura ambiente per permettere la migrazione delle larve attraverso il setaccio fino alla provetta. Il giorno dopo abbiamo riposto il contenuto della provetta in una piastra Petri ed effettuato la lettura con uno stereo microscopio.
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5- I campioni risultati positivi ad uno o entrambi i kit utilizzati per la diagnosi di giardiasi, sono stati conservati a -20°C per la successiva caratterizzazione molecolare presso i laboratori di Parassitologia del Dipartimento di Scienze Cliniche e Medicina Traslazionale dell’ Università di Roma Tor Vergata, con la collaborazione della Dott.ssa Federica Berrilli.
Tale procedura di genotipizzazione prevede vari step: - Estrazione del DNA
- Amplificazione del DNA (PCR) - Elettroforesi
- Purificazione del DNA - Sequenziamento
Estrazione del DNA
Prima dell’esecuzione della PCR abbiamo dovuto provvedere alla tecnica di estrazione del DNA utilizzando il QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN).
I campioni di feci di solito contengono molti composti che possono degradare il DNA e inibire le successive reazioni di amplificazione. Per assicurare la rimozione di queste sostanze, il kit QIAamp DNA Stool Mini Kit utilizza delle apposite pasticche InhibitEX, un reagente in forma solida che, addizionato al lisato, è in grado di assorbire efficientemente
e velocemente proteine, nucleasi, impurità ed altri composti inibitori nelle prime fasi del
processo di purificazione, in modo che possano essere facilmente rimossi in una successiva fase di centrifugazione. La lisi delle cellule si esegue mediante il buffer ASL che avviene, nel caso di cellule di batteri e parassiti, tra i 70-90 °C con l’utilizzo della proteinasi K e l’adsorbimento del DNA alla membrana di silicio delle minicolonne. Il protocollo che abbiamo utilizzato è riportato nelle note a piè pagina. *
1) Pesare 180-220 mg di feci e trasferirle in una provetta da 2 ml. Nel nostro caso abbiamo cercato di uniformare i campioni e scegliere un peso di 200 mg per tutti più o meno uguale.
2) Aggiungere 1,4 ml di tampone ASL. Agitare mediante vortex per 1 min fino. 3) Riscaldare la sospensione per 5 min a 95 °C.
4) Agitare mediante vortex per 15 sec e centrifugare alla massima velocità (14,000 rpm) per 1 min. 5) Trasferire 1,2 ml di surnatante in una nuova provetta da 2 ml e scartare il pellet.
6) Aggiungere una Inhibitex Tablet per ogni campione e agitare immediatamente mediante vortex per 1 min o fino a quando la compressa è completamente sciolta. Incubare la sospensione per 1 min a temperatura ambiente.
63 Protocollo di Amplificazione
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica che consente di ottenere rapidamente milioni di copie di DNA a partire da quantità estremamente ridotte di acido nucleico; si tratta di una reazione di amplificazione in vitro di uno specifico frammento di DNA per mezzo di una DNA polimerasi.
Per la caratterizzazione molecolare di G. duodenalis nel nostro lavoro si è scelto di amplificare un frammento del gene 18S. Il locus 18S RNA ribosomiale (18S rRNA) è una componente della piccola subunità ribosomiale eucariote. Le sequenze ottenute con questi geni sono frequentemente utilizzate in studi filogenetici. Inoltre, essendo un gene multi copia favorisce un maggior successo di amplificazione, dovuto all’aumentata disponibilità del materiale di partenza.
Nel nostro lavoro è stato applicato un protocollo di nested-PCR per aumentare la sensibilità della tecnica. La prima reazione di PCR è stata utilizzata per ottenere l’amplificazione di un frammento di circa 292 bp. Sono stati utilizzati i seguenti primers:
Rh11 forward: 5’ CATCCGGTCGATCCTGCC 3’
7) Centrifugare il campione a 14,000 rpm per 3 min.
8) Trasferire tutto il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet. Centrifugare alla massima velocità per 3 min.
9) Aggiungere 15 μl di proteinasi K in una nuova provetta da 1,5 ml. 10) Trasferire 200 μl di surnatante nella provetta contenente proteinasi K. 11) Aggiungere 200 μl di Buffer AL e agitare mediante vortex per 15 sec.
12) Incubare a 70 °C per 2 ore. Centrifugare brevemente per rimuovere eventuali gocce dal tappo. 13) Aggiungere 200 μl di etanolo (96-100%) al lisato e mescolare mediante vortex. Centrifugare brevemente
14) Trasferire in una minicolonna QIAamp da 2 ml fornita dal kit tutto il contenuto ottenuto dallo step precedente e centrifugare a 14,000 rpm per 1 min. Trasferire la colonnina in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e scartare il tubo contenente il filtrato
15) Aggiungere 500 μl di Buffer AW1. Centrifugare a 14,000 rpm per 1 min. Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml, e scartare il tubo contenente il filtrato.
16) Aggiungere 500 μl Buffer AW2. Centrifugare a 14,000 rpm per 3 min. Scartare il tubo contenente il filtrato.
17) Trasferire la colonnina in una nuova provetta da 2 ml e scartare il tubo contenente il filtrato. Centrifugare a 14,000 rpm per 1 min.
18) Trasferire la colonnina in una nuova provetta da 1,5 ml. Aggiungere 200 μl di buffer AE direttamente sulla membrana della colonnina spin QIAamp. Incubare per 1 minuto, quindi centrifugare a massima velocità per 1 min per l’eluizione finale del DNA.
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Rh4 reverse: 5’ AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAGG 3’ (Hopkins et al,. 1997) La composizione della mix di reazione, per un totale di 25 μl, è stata:
- PCR master mix 2X (Promega) 12,5 μl
- Primer Forw Rh4 1 μl (20 pmol) - Primer Rev Rh11 1 μl (20 pmol) - DNA 6 μl
- BSA (Sieroalbumina bovina) 0,5 μl (2X) - DMSO (dimetilsolfossido) 0,5 μl (0.28 M)
- H2O distillata sterile 3,5 μl
La master mix (Promega) è una soluzione a concentrazione 2X e include la DNA Taq polimerasi (50 unità/ml), dNTPs (400 μM ciascuno), MgCl2 (3mM), essenziale cofattore della Taq polimerasi.
Le condizioni di amplificazione sono state le seguenti:
- un ciclo di attivazione iniziale della Taq polimerasi a 95°C per 2 minuti;
- 35 cicli di amplificazione comprendenti uno step di denaturazione a 95°C per 45 secondi, uno step di annealing a 65°C per 45 secondi, uno step di allungamento a 72°C per 45 secondi;
- uno step finale di estensione di 7 minuti a 72°C.
È stato poi eseguito il secondo step di nested PCR: consiste in una seconda PCR condotta sui prodotti della prima PCR usando primer complementari a regioni della stesso segmento di DNA ma interne rispetto alle regioni di annealing della prima coppia di primer.
La seconda reazione di PCR è stata utilizzata per ottenere l’amplificazione di un frammento di circa 180 bp. I primers utilizzati sono:
GiarR reverse: 5’ CTGCGTCACGTGCTCG 3’
GiarF forward: 5’ GACGCTCTCCCCAAGGAC 3’ (Read et al., 2004)
La composizione della mix di reazione, per un totale di 25 μl, è stata simile a quella usata per la prima PCR, abbiamo cambiato solamente la quantità di DNA che in questo caso è stata di 3 μl e per bilanciare abbiamo aumentato l’H2O a 6,5 μl.
In tutte le amplificazioni eseguite è stato inserito un controllo negativo, per escludere eventuali contaminazioni, e un controllo positivo per Giardia.
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Elettroforesi su gel di agarosio
Terminata la reazione di nested è stato preparato un gel di agarosio al 2% con 60 ml di tampone (buffer TBE 10x, soluzione salina per stabilizzare il gel) e 1,2 gr di agarioso. Al gel è stato aggiunto un intercalante (6 μl, SYBR Safe DNA gel stain, Invitrogen). Una
volta polimerizzato, si è proceduto al caricamento di 5 μl di amplicone addizionato a 2 μl
di Loading Dye (Promega). Infine sono stati caricati 10 μl di marcatore molecolare 100 bp DNA Ladder (Promega), per valutare il peso molecolare delle bande ottenute. Al termine della migrazione elettroforetica (corsa a 130 Watt), i prodotti di PCR sono stati letti esponendo il gel ad un transilluminatore a luce UV di 300 nm.
Purificazione del DNA
Gli amplificati, sono stati purificati per il sequenziamento usando il kit mi-PCR Purification della Metabion International AG, secondo il protocollo previsto dalla casa produttrice descritto nella nota a piè pagina.
Sequenziamento e analisi dei dati
I frammenti di DNA amplificati, purificati e con una quantità sufficiente di DNA, sono stati sequenziati presso la Bio-Fab Research s.r.l. (Roma). Per il locus 18S l’attribuzione del genotipo è stata effettuata mediante il confronto delle sequenze ottenute con quelle dei genotipi A→H depositate in GenBankTM.
1) Aggiungere 10-100 μl di prodotto della PCR in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 0,5 ml di Buffer PX; miscelare bene.
2) Mettere il contenuto del primo step in una minicolonna con Collection Tube 3) Centrifugare per 60 secondi a 14.000 rpm. Scartare il filtrato.
4) Lavare la colonna con 0,5 ml di Buffer WN centrifugando per 60 secondi a 14.000 rpm. Scartare il filtrato.
5) Lavare la colonna con 0,5 ml di Buffer WS centrifugando per 60 secondi a 14.000 rpm. Scartare il filtrato.
6) Centrifugare di nuovo a massima velocità per 5 minuti per rimuovere l’etanolo residuo. 7) Lasciare aperto il tappo per 5 minuti per far evaporare l’alcool.
8) Mettere la minicolonna in un nuovo Collection Tube da 1,5 ml. Aggiungere 30 μl di acqua distillata al centro della membrana.
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Le analisi statistiche sono state effettuate con Graphpad Prism® e sono stati considerati significativi valori di p < 0.05.
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