Aspetti clinici e parassitologici della giardiasi nel cane

Università degli Studi di Pisa

Dipartimento di Scienze Veterinarie

Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria

Aspetti clinici e parassitologici della

giardiasi nel cane

Candidato

Relatore

Cristina Procopio

Prof.ssa Veronica Marchetti

Correlatore

Dott.ssa Federica Berrilli

INDICE

Riassunto/Abstract

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3

CAPITOLO 1.

Giardia duodenalis

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1.1 Tassonomia, ciclo biologico e assemblaggi

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5

1.2 Epidemiologia

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13

1.3 Patogenesi

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16

1.4 Sintomatologia

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1.5 Diagnosi

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21

1.6 Terapia

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26

1.7 Prevenzione

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31

CAPITOLO 2. Le

Enteropatie Croniche

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2.1 Sintomatologia Diarroica

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2.2 Enteropatie Food Responsive (FRE)

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38

2.3 Enteropatie Antibiotic Responsive (ARE)

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40

2.4 Inflammatory Bowel Disease (IBD)

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44

2.5 Enteropatie proteino-disperdenti

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CAPITOLO 3.

Obiettivo dello Studio

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CAPITOLO 4.

Materiali e Metodi

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CAPITOLO 5.

Risultati

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67

CAPITOLO 6.

Discussioni

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81

3

Riassunto/Abstract

Parole chiave: cane, Giardia, enteropatia, genotipo.

Giardia duodenalis è un protozoo intestinale a distribuzione cosmopolita e in grado di infettare un elevato numero di specie di mammiferi. La patologia correlata, detta giardiasi, oltre ad essere di rilevanza clinica nei cani è anche considerata una importante zoonosi. I tassi di prevalenza nei cani variano a seconda della popolazione oggetto di studio e del metodo diagnostico utilizzato. In questo studio abbiamo valutato sia la possibile relazione tra l’index clinico di gravità valutato tramite il CCECAI, la caratterizzazione delle feci e il tipo di enteropatia con la presenza di Giardia sia la genotipizzazione degli assemblaggi. Sono stati arruolati 47 cani con diagnosi di enteropatia cronica, di cui 16 con diagnosi di giardiasi effettuata tramite due diversi kit ELISA. Sui positivi è stata poi effettuata la PCR. Abbiamo diviso i soggetti in due gruppi. Non abbiamo riscontrato differenze statisticamente significative tra i positivi e i negativi per Giardia per nessuno dei parametri analizzati. Si evince dunque che la presenza del protozoo non sembra essere associata a specifiche condizioni enteropatiche né correlare con la gravità della sintomatologia cronica. Tramite genotipizzazione abbiamo ottenuto gli assemblaggi di appartenenza in 6 cani su 14, di cui D (83,33%) e C (16,67%), entrambi specie-specifici del cane.

4 Key words: dog, Giardia, enteropathy, genotype.

Giardia duodenalis is an intestinal protozoa, which is widespread all over the world and

able to infect a large number of mammalians. The related disease, called giardiasis, in addition to being clinically relevant in dogs, it is also considered to be an important zoonosis. The prevalence rates in dogs vary according to the population object of study and the diagnostic method used. In this study we analyzed the possible association between clinical gravity index evaluated by CCECAI, the characterization of faeces and the kind of enteropathy with the presence of Giardia, as well as the molecular typing. We enrolled 47 dogs with a diagnosis of chronic enteropathy, in 16 of them we found giardiasis diagnosed by two different ELISA tests. Positive samples have been studied with PCR. The population was divided into two groups. No statistically significant difference was found between the two groups for none of the examined parameters. We can suppose, in the light of the results obtained, that the presence of the protozoa is not associated with the clinical effects nor the gravity of chronic symptomatology. By genotypization, we obtained assemblages in 6 out of 14 dogs: D (83,33%) and C (16,67%), both dogs species-specific.

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Primo Capitolo

Giardia duodenalis

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Tassonomia, ciclo biologico e

assemblaggi

Da oltre 300 anni, da quando l'agente eziologico della giardiasi è stato osservato per la prima volta da Van Leeuwenhoek, Giardia duodenalis (sinonimo di Giardia intestinalis o Giardia lamblia) continua ad essere uno degli agenti patogeni protozoari intestinali più comunemente riportati negli esseri umani, negli animali domestici e nella fauna selvatica.

Giardia duodenalis è un organismo eucariote unicellulare, protozoo flagellato

responsabile della giardiasi. Secondo una vecchia classificazione basata sulla morfologia, Giardia appartiene al Phylum Sarcomastigophora, Subphylum Mastigophora (= flagellata), Classe Zoomastigophorea, Ordine Diplomonadida e famiglia Hexamitidae (Morrison et al., 2007). Secondo una nuova sistematica sulla base dei dati genetici, strutturali e biochimici Giardia apparterrebbe, invece, al Phylum Metamonada, Subphylum Trichozoa, Superclasse Eopharyngia, classe Trepomonadea, sottoclasse Diplozoa, Ordine Giardiida e famiglia Giardiidae (Cavalier-Smith, 2003).1

Giardia duodenalis è un organismo molto particolare, apparentemente arcaico, in

quanto condivide molte caratteristiche con i procarioti anaerobi. Possiede diverse caratteristiche inusuali, tra cui la presenza di due nuclei diploidi, vacuoli periferici, mitosomi e un organello di attacco particolare denominato disco ventrale. 2 I mitosomi sono degli organuli citoplasmatici osservati in alcuni eucarioti; essi contengono proteine implicate nella biosintesi dei legami Fe-S e nella biogenesi degli organelli. Uno studio del 2005 ha messo in evidenza che i mitosomi e i mitocondri condividono una modalità simile di traslocazione delle proteine. Il fatto che riconoscano le stesse proteine target, supporta l’ipotesi che essi rappresentino in realtà diverse forme dello

6

stesso organulo fondamentale che si è evoluto a seconda delle diverse pressioni selettive.3

Il protozoo manca però di alcuni comuni compartimenti subcellulari eucariotici come i mitocondri, i perossisomi, e anche di un tradizionale apparato del Golgi. Nonostante ciò, delle specifiche vescicole di incistamento (ESV), che si formano appunto durante il processo di incistamento del parassita e che contengono il materiale che andrà a costituire la parete della cisti, mostrano caratteristiche biochimiche simili alla maturazione delle cisterne del Golgi. 1

Il ciclo di Giardia duodenalis, a discapito della complessità della sua patogenesi, è molto semplice e di tipo monoxeno, in quanto non prevede la presenza di ospiti intermedi. Gli stadi del ciclo biologico sono solo due: la cisti e il trofozoita, che si trasformano l’uno nell’altro tramite processi di incistamento e disincistamento.

Le cisti dormienti ma già infettanti e, in alcuni casi anche i trofozoiti, sono emesse all’esterno con le feci degli animali parassitati. Le cisti, delle dimensioni di circa 8-12µm x 7-10µm sono resistenti nell’ambiente e possono persistere per mesi nel suolo o nell’acqua 4 sonoperò sensibili all’essiccazione in condizioni di temperature elevate e bassa umidità. 5

Ciascuna cisti contiene due trofozoiti, con i loro assonemi, i frammenti del disco ventrale e i quattro nuclei. In seguito all’ingestione accidentale da parte di un ospite sensibile, le cisti diventano metabolicamente attive e dopo circa 15 minuti dall’ingestione vanno incontro ad un processo di disincistamento a livello duodenale. 6 Il processo di disincistamento avviene in seguito al contatto con gli acidi gastrici e gli enzimi pancreatici, ma anche grazie ad una cisteina proteasi prodotta nei vacuoli periferici del protozoo e alla de-fosforilazione delle proteine che costituiscono la parete della cisti. 7,8

Durante questo processo si verificano anche cambiamenti di espressione di alcuni geni, pochi dei quali sono stati identificati. 4

I due trofozoiti contenuti nella cisti completano rapidamente la loro maturazione e vanno ad aderire, per mezzo del disco ventrale, all’orletto a spazzola delle cellule epiteliali che costituiscono i villi intestinali. La distribuzione di Giardia nel tratto

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intestinale varia a seconda dell’ospite e della sua dieta: nei cani i trofozoiti si localizzano dal duodeno all’ileo, mentre nei gatti predominano nel digiuno e nell’ileo. 9 I trofozoiti si moltiplicano per scissione binaria e poi si incistano secondo un meccanismo ancora poco conosciuto. 10 La trasformazione del trofozoita in cisti avviene comunque quando si verificano cambiamenti nel circostante ambiente interno e quando il parassita viene a trovarsi in condizioni di stress. 11 Il processo di incistamento viene anche indotto in risposta a fattori specifici dell’ospite quali elevati livelli di bile, bassi livelli di colesterolo e un pH basico 12 ed ha inizio durante il passaggio attraverso il colon.

I flagelli si introflettono, il disco adesivo si frammenta e il parassita perde la capacità di attacco ai villi intestinali. Il trofozoita assume una forma rotondeggiante e riduce il suo metabolismo trasformandosi in una cisti. Queste ultime presentano una parete spessa (0,3-0,5 µm) e all’interno quattro nuclei e strutture microtubulari nastriformi che si dipartono dal disco adesivo disassemblato. La parete è altamente insolubile grazie alle forti interazioni tra le catene di carboidrati così come quelle tra gli zuccheri e le proteine ed è costituita principalmente da N-acetil-galattosamina e tre diverse proteine di parete (CWP1, CWP2 e CWP3). 4

L’incistamento può essere diviso in una fase iniziale e una fase tardiva. Nella fase iniziale diventano visibili vescicole specifiche che trasportano selettivamente le proteine che andranno a costituire la parete della cisti. Inizia la replicazione del DNA per poi interrompersi precocemente in fase G2, si avrà così una cellula contenente due nuclei tetraploidi. Durante la fase tardiva, questi nuclei si dividono (dando luogo a quattro nuclei diploidi) e il DNA si replica ancora una volta con la generazione di una cisti con quattro nuclei aploidi. 4

Le cisti iniziano ad essere eliminate con le feci a partire da pochi giorni dopo l’infezione primaria e la durata complessiva del ciclo vitale è compresa tra i quattro e i quindici giorni.

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Figura 1: Ciclo e Patogenesi di Giardia duodenalis

Da: Greene, Infectious Disease of the Dog and Cat, Elsevier Saunders, 2012

I trofozoiti (12-15 µm di lunghezza e 5-9 µm di larghezza) possono essere identificati al microscopio ottico con il caratteristico aspetto di “faccia sorridente”, rappresentata da due nuclei nel terzo anteriore che formano gli occhi, gli assonemi posizionati longitudinalmente tra i nuclei a formare il naso, e i corpi mediani, strutture costituite

9

da microtubili a funzione ancora sconosciuta, localizzati nel terzo posteriore che formano la bocca. 13

I flagelli e il disco adesivo sono composti dalle classiche proteine che costituiscono il citoscheletro come l’α-tubulina e la β-tubulina insieme con le proteine della famiglia giardina (α-Giardin, β-Giardin, γ-Giardin e δ-giardin), che è una famiglia unica per

Giardia spp. 4

Figura 2: Morfologia del trofozoita di Giardia duodenalis

Da : Monis, P. T., Caccio, S. M., & Thompson, R. C. A. (2009). Variation in Giardia : towards a taxonomic revision of the genus, (January), 93–100

I trofozoiti alternano fasi di attacco alla mucosa e fasi in cui sono liberi di muoversi all’interno dell’intestino. Essi possono essere eliminati con le feci e sono infettanti, ma fuori dall’ospite muoiono molto rapidamente. 11 I due nuclei dei trofozoiti di Giardia

duodenalis sono di uguali dimensioni ed entrambi trascrizionalmente attivi.

Inizialmente si pensava che fossero perfettamente identici ma in realtà ciò è stato smentito da studi in cui è stato evidenziato che la distribuzione asimmetrica e il numero dispari di cromosomi sta ad indicare che, almeno per alcuni cromosomi, uno o entrambi i nuclei sono aneuploidi. 14

10

Avere due nuclei con espressione genica asimmetrica determina possibilità uniche per quanto riguarda la regolazione dell'espressione genica, e questo potrebbe essere uno dei motivi della presenza di due nuclei nei Diplomonadida. 4

Anche se i Diplomonadida, tra cui appunto Giardia duodenalis, non sono noti per avere un ciclo sessuale, studi genetici indicano l'esistenza di scambio genetico e una fase sessuale nel ciclo del parassita. In effetti questo protozoo potrebbe rappresentare una fase pre-meiotica nell’evoluzione degli eucarioti. Marilee A. Ramesh et al. in uno studio pubblicato nel 2005 dopo un esame del genoma di Giardia hanno identificato e analizzato cinque geni che codificano per proteine meiosi-specifiche, ampiamente presenti tra gli eucarioti sessuali meiotici. 15

Giardia ha inoltre bassi livelli di eterozigosi allelica, e questo indicherebbe che i due

genomi nucleari possano scambiarsi materiale genetico. L’ibridazione fluorescente in situ eseguita con sonde dirette ad un plasmide episomiale suggerisce che gli episomi, presenti in uno solo dei due nuclei del trofozoita, vengano trasferiti tra i nuclei all’interno della cisti. 16 L'episoma è un elemento genetico che può integrarsi, attraverso un processo di ricombinazione, in un cromosoma del genoma.

Sei specie di Giardia sono state distinte sulla base di diverse caratteristiche osservate al microscopio ottico (forma del trofozoita e dei corpi mediani) e al microscopio elettronico (flangia ventrolaterale, scanalatura marginale, disco ventrale, flagellum). 17 Le diverse specie di Giardia sono state isolate da anfibi (G. agilis), uccelli (G. ardeae,

G. psittaci), topi (G. muris) e arvicole (G. microti). La sesta specie (G. duodenalis)

comprende ceppi isolati da una vasta gamma di ospiti mammiferi, raggruppati in un’unica specie perché condividono caratteristiche morfologiche simili. 1

Attualmente sono riconosciuti otto assemblaggi genotipici diversi di Giardia duodenalis (A-H), che rappresentano distinte linee evolutive. Gli esseri umani sono generalmente interessati dagli assemblaggi A e B, i cani principalmente dagli assemblaggi ospite-specifici C e D, e i gatti con quelli di tipo F. Tuttavia, in numerose specie animali, tra cui cani e gatti, sono stati segnalati assemblaggi A o B. 18

Nell’uomo, a livello mondiale la prevalenza dell’assemblaggio B (circa 58%) sembra essere più elevata di quello A (circa 37%). La prevalenza delle infezioni miste è maggiore nei paesi in via di sviluppo (5.2%) rispetto a quelli sviluppati (3.2%).19

11

L’assemblaggio A è stato ulteriormente suddiviso in sottotipi da AI ad A-IV: AI è stato segnalato nell'uomo e negli animali, A-II negli esseri umani, A-III ed A-IV esclusivamente negli animali. 18

Ciononostante, l’assemblaggio A-II, considerato specifico dell’uomo, è stato recentemente identificato in campioni fecali di cani in alcuni studi eseguiti in India e Messico. 20, 21

La distribuzione delle forme zoonotiche dipende dall’ambiente in cui l’animale vive e dall’adattamento all’ospite. I cani e i gatti, compresi quelli che vivono nei canili e nei gattili, sono infetti prevalentemente dagli assemblaggi C, D, e F. I pets possono però essere infettati anche dagli assemblaggi zoonotici A-II e, meno comunemente, B. 22

La genotipizzazione e l'ulteriore sub-tipizzazione ha fatto affidamento soprattutto sull’analisi di sequenze di frammenti di geni bersaglio in singola copia, come ad esempio la trioso-fosfato isomerasi (TPI), le β-giardine (bg) o la glutammato deidrogenasi (GDH). Tuttavia, questo approccio viene ora riesaminato; ci sono infatti delle discrepanze tra questi tre loci a causa dell’elevato polimorfismo che li caratterizza. Si rischia di inserire uno stesso campione in un assemblaggio diverso in base al gene preso in considerazione. L'analisi della sequenza di un singolo locus non può quindi, ad oggi, essere utilizzata per la classificazione tassonomica. 18

Recentemente la divisione genotipica all'interno delle diverse specie di Giardia sembra certamente molto più complessa di quanto ritenuto in precedenza, di conseguenza sono anche cambiate le regole per la determinazione del sub-assemblaggio, che viene ora determinato sulla base di tre diversi loci e non più sulla base di un gene. 1

Tutto ciò è stato confermato in un recente studio effettuato in Germania (L.Pallant et al., 2015) in cui su cani e gatti positivi per Giardia sono stati applicati metodi di genotipizzazione multi locus, e i risultati confermano appunto l’importanza di questo approccio e soprattutto l’importanza di includere il locus 18S rDNA. 23

Nonostante la genotipizzazione multilocus sia più accurata rispetto a quella che utilizza un solo gene, alcuni isolati non possono comunque essere inequivocabilmente assegnati ad un determinato assemblaggio. La discordanza nei risultati di tipizzazione è stata osservata in isolati di G. duodenalis sia di origine umana che animale, e può essere formalmente spiegata da due meccanismi distinti (Sprong et al., 2009): la

12

presenza di cisti geneticamente differenti nello stesso campione fecale o l'esistenza di isolati ricombinanti in cui si sono verificati scambi genetici a livello dei geni target della PCR. 19

Figura 3: Le diverse specie di Giardia e gli assemblaggi di Giardia duodenalis

Da: Yaoyu F, Xiao L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis.

13

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Epidemiologia

L’infezione causata da G. duodenalis è considerata una zoonosi cosmopolita. La trasmissione del protozoo avviene in maniera diretta, per via oro – fecale, e frequentemente con l’ingestione di acqua e alimenti contaminati. L’acqua svolge un ruolo molto importante come veicolo di trasmissione dell’infezione. Insieme a Cryptosporidium, Giardia è infatti considerato tra i più diffusi waterborne pathogens, rappresentando un importante problema di sanità pubblica sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo. I processi di filtrazione sono fondamentali ai fini della rimozione delle cisti dalle acque potabili. Anche la contaminazione di frutta, verdura e molluschi bivalvi con le cisti di Giardia rappresenta un importante rischio per la salute pubblica, poiché questi prodotti sono spesso consumati crudi, senza trattamento termico. 24

Il periodo prepatente di Giardia duodenalis è approssimativamente di 8 giorni (con un range tra i 4 e i 12). 5

Un limitato numero di cisti (10-100) può avviare l’infezione nell’uomo. 25

Molti animali infetti possono eliminare le cisti attraverso le feci per diversi mesi. 5 È stato riportato in uno studio che i cani infetti esaminati eliminavano in media tra le 26 e 114,486 cisti per grammo di feci. 26

A differenza di coccidi e elminti, le cisti di Giardia non richiedono un periodo di maturazione nell’ambiente, ma sono in grado di infettare un nuovo ospite appena emesse con le feci. 1

Nei cani, le infezioni sono più comuni negli animali giovani (meno di un anno di età) e la diarrea è il segno clinico principale (Gate & Nolan del 2009, Epe et al. 2010). 27, 28 I tassi di prevalenza della giardiasi nei cani variano a seconda della popolazione oggetto di studio e del metodo diagnostico utilizzato, e possono raggiungere il 45%. 18 In Italia, la prevalenza di giardiasi varia da 0.9 a 4.7% nei bambini e da 3.6 a 74% nei cani e le prevalenze più elevate si riscontrano nei canili. 29

Un recente studio eseguito a livello Europeo (Epe et al., 2010), ha valutato la prevalenza della giardiasi tramite l’utilizzo dell’IDEXX SNAP Giardia Test (IDEXX Laboratories) in cani e gatti sintomatici di proprietà. L’analisi dei dati ha mostrato una

14

prevalenza del 24,78% nei cani e del 20,3% nei gatti oggetto di studio. Sono state anche osservate differenze tra i vari Paesi. Il tasso di positività era inferiore nel Regno Unito, Spagna, Paesi Bassi, Italia, rispetto a Germania e Belgio. 28

È stato messo in evidenza che esistono due cicli di trasmissione negli ambienti urbani con la trasmissione di assemblaggi cane-specifici tra i cani e la possibile trasmissione dell’assemblaggio A tra cani e uomo. 19

La trasmissione dei genotipi specifici del cane può essere favorita da intensi contatti tra un gran numero di cani che vivono insieme e può competere con la trasmissione di altri genotipi. Nei cani di proprietà, la frequenza di trasmissione degli assemblaggi C o D può essere inferiore, e di conseguenza, le infezioni sostenute dall’assemblaggio A possono prevalere. 30

Uno studio eseguito su una popolazione di cani negli Stati Uniti occidentali ha dimostrato che nei cani che vivono in ambiente urbano gli assemblaggi zoonotici si riscontrano più frequentemente degli assemblaggi ospite-specifici. I cani devono pertanto essere considerati un potenziale serbatoio di infezione per gli esseri umani. 31 Alcuni studi effettuati in Europa sostengono questi risultati, confermando le alte percentuali dell’assemblaggio A rilevato in isolati di cani di proprietà in Germania 32, e alte percentuali invece di assemblaggi di tipo C e D riscontrate nei cani dei canili, in Lazio. 33

Ciò è stato ulteriormente confermato da uno studio in Belgio, dove l'80.5% dei 41 cani di proprietà positivi a Giardia presentava un assemblaggio di tipo A, mentre i cani di canile o allevamento e cani clinicamente sintomatici eliminavano principalmente assemblaggi specie-specifici C e D (93.9% C e 80.0% D). 34

In alcune altre indagini, però, i risultati sono contrastanti e i cani di proprietà hanno mostrato di essere infetti principalmente dagli assemblaggi C e D. 35

Nonostante non sia stata documentata nessuna trasmissione definitiva tra animali ed esseri umani, dati provenienti da studi di sorveglianza trasversali e valutazioni durante le epidemie di giardiasi implicano la possibile trasmissione dagli animali all'uomo. 22 La caratterizzazione molecolare delle cisti di Giardia duodenalis provenienti da esseri umani e animali che vivono in contesti ben definiti è utile per studiare la circolazione

15

degli isolati e rappresenta uno strumento per valutare il rischio di infezioni zoonotiche. L’infezione da Giardia nei bambini che vivono in una comunità Rom e in cani randagi presenti nello stesso contesto è stata valutata attraverso l'analisi microscopica e molecolare in uno studio di Marangi et al. del 2010. Lo studio dimostra l'infezione da parte dell’assemblaggio A-I di Giardia sia nei cani che nei bambini. Questi risultati forniscono prove a sostegno del potenziale ruolo dei cani nella trasmissione zoonotica di Giardia all'interno della comunità Rom oggetto di studio. 36

Gli animali sani comunque non sono considerati un rischio per la salute umana da parte del Center for Disease Control and Prevention (CDC) e non ci sono attualmente raccomandazioni a testare cani e gatti asintomatici per l'infezione da Giardia. 37

Iniziali ricerche per valutare le associazioni tra specifici genotipi di Giardia e lo sviluppo di sintomi nell’uomo non hanno fornito risposte inequivocabili. Alcuni studi suggeriscono che l’assemblaggio B è più probabile che sia associato con la malattia rispetto all’assemblaggio A, mentre altri studi suggeriscono il contrario. 38 Sembrerebbe che ci sia un'interazione più complessa tra ospite e parassita a determinare se l'infezione sia asintomatica o si traduca in malattia clinica. Analogamente, tutti i quattro genotipi che si riscontrano nei cani sembrano essere in grado di causare la sintomatologia. 39

L'incidenza della giardiasi negli animali è maggiore nelle popolazioni di cani e gatti in strutture di allevamento e nei rifugi con scarse condizioni igieniche e/o sovraffollati. In queste strutture, oggetti contaminati da cisti, come le ciotole per il cibo e le gabbie, possono rappresentare la fonte principale di infezione.

I fattori di rischio per l’uomo sono l'età, l’ambiente in cui vive, lo stile di vita e lo stato immunitario. Nel caso degli animali essi includono la giovane età, l’essere sottoposti a situazioni stressanti e le condizioni ambientali non igieniche. 11

16

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Patogenesi

La patogenesi della giardiasi è abbastanza complessa ma è sicuramente l’intrecciarsi di più fattori a determinare lo stadio clinico di malattia. Giardia non è un parassita invasivo, nell’ospite vive e si riproduce grazie ad una moltiplicazione asessuata sulla superficie del lume del piccolo intestino.

La virulenza di Giardia duodenalis è legata a fattori sia dell’ospite che del parassita stesso, come è stato osservato in uno studio nel corso di un’infezione sperimentale nell’uomo. 40

I fattori associati all’insorgere della malattia includono lo stato clinico e nutrizionale del soggetto, l'età e la risposta del sistema immunitario, che coinvolge mastociti, linfociti B e T, cellule dendritiche, Ig A e ossido nitrico. 41

I meccanismi patogenetici di Giardia proposti includono la produzione di tossine, l’alterazione della normale flora intestinale, l'induzione di infiammazione, l'inibizione della normale funzione enzimatica degli enterociti, l’appiattimento dei microvilli, l’induzione di disturbi della motilità e dell’apoptosi delle cellule epiteliali intestinali. 37 La virulenza del trofozoita dipende in larga misura dalla sua mobilità, mediata da otto flagelli presenti in quattro coppie, e dalla funzione di attacco del disco ventrale alla cellula ospite. 22 Il disco ventrale garantisce al protozoo un sicuro ancoraggio anche

durante le contrazioni peristaltiche intestinali.

Un’altra arma fondamentale di Giardia è la grande variabilità antigenica, e la capacità di modificare le VSPs (variant-specific surface proteins), proteine che ricoprono l’intera superficie del trofozoita, per sfuggire alla clearance da parte delle IgA. 4

Vari studi nel corso degli anni hanno suggerito diversi meccanismi patogenetici, tra cui danni diretti causati dal parassita, infiammazione delle mucose in seguito all'infiltrazione da parte di linfociti e mastociti, deconiugazione dei sali biliari e inibizione della tripsina. Inoltre, è stato anche evidenziato un aumento della peristalsi intestinale e della contrattilità della muscolatura liscia. Dati più recenti hanno evidenziato anche un ruolo importante dell’apoptosi. 4 Questa avviene sia per via diretta che indiretta. 42 La via estrinseca è mediata dal legame di un ligando

17

extracellulare ad un recettore trasmembrana, nella via intrinseca invece il punto cruciale è la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna.

Giardia induce quindi apoptosi degli enterociti che si correla con la perdita della

funzione della barriera epiteliale tramite l'interruzione della tight junction ZO-1 e il conseguente aumento della permeabilità, e questo danno è dipendente dal rilascio di caspasi 3. 43 Studi successivi hanno poi messo in evidenza l’attivazione anche di caspasi 8 e 9. 42 Le caspasi sono proteasi specifiche per cisteine e aspartati che dirigono la distruzione degli elementi strutturali (citoscheletro) e funzionali (organuli citoplasmatici) delle cellule.

L'interazione ospite-parassita porta all'up-regulation dei geni coinvolti nella cascata apoptotica e nella formazione di radicali liberi all’interno delle cellule intestinali. I risultati di alcuni studi indicano un nuovo meccanismo biologico in cui l’attivazione del cotrasportatore SGLT-1 (sodium glucose trasporter), migliorando l'assorbimento del glucosio, può salvare gli enterociti dall’apoptosi. 44

L’apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e la riduzione della superficie di assorbimento e degli enzimi digestivi causano, in ultimo, la diarrea.39

Il danno agli enterociti è mediato dall’attivazione dei linfociti T in seguito alla rottura da parte del protozoo delle tight junctions delle cellule epiteliali, aumentando la permeabilità intestinale e la distruzione degli enterociti. È stato anche dimostrato che le cellule caliciformi nei cani affetti da giardiasi diventano iperplasiche e generano dei gates che permettono l’invasione dei tessuti da parte dei trofozoiti. 11

Giardia duodenalis altera anche le claudine, proteine epiteliali componenti delle

giunzioni strette. Nonostante queste variazioni nella permeabilità, il parassita può causare sintomi clinici in assenza di cambiamenti microscopici, come atrofia dei villi o lesioni della mucosa. 44

L’infezione da parte di Giardia stimola la secrezione di cloro e ciò si traduce in una riduzione diffusa della lunghezza dell’orletto a spazzola dei microvilli, portando ad una cattiva digestione e malassorbimento di glucosio, sodio e acqua e alla ridotta attività delle disaccaridasi. In associazione al malassorbimento di sodio/glucosio può essere osservato microscopicamente un aumentato numero di linfociti intraepiteliali. La

18

perdita della funzione della barriera epiteliale può portare a disturbi intestinali cronici, ma i meccanismi rimangono comunque poco chiari. 5

Giardia può provocare segni clinici simili alla sindrome dell'intestino irritabile

nell’uomo e la giardiasi è associata a variazioni istopatologiche comuni alle allergie alimentari o all’IBD. Non si conosce ancora bene il meccanismo per cui alcuni esseri umani ed animali mantengano un’infezione cronica subclinica. 5

Le iniziali ricerche riguardo le associazioni tra specifici genotipi di Giardia e lo sviluppo della malattia non hanno fornito risposte univoci. Alcuni studi suggeriscono che l’assemblaggio B sia associato più frequentemente con la malattia clinica rispetto all’assemblaggio A, mentre altri studi suggeriscono il contrario. 38

L’infezione da parte di Giardia comunque non induce una immunità permanente, quindi è probabile che si verifichi una re-infezione che può essere confusa con infezioni resistenti. 37

.

Figura 4 : Principali Fattori di Virulenza di Giardia spp.

Da: Ankarklev, J., Jerlström-Hultqvist, J., Ringqvist, E., Troell, K., & Svärd, S. (2010). Behind the smile: cell biology and disease mechanisms of Giardia species. Nature Reviews. Microbiology, 8(6), 413–422

19

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Sintomatologia

Le manifestazioni cliniche della giardiasi sono molto variabili e vanno dall’assenza di sintomi a una diarrea acuta o cronica con disidratazione, dolore addominale, nausea, vomito e perdita di peso.

Anche se la giardiasi è considerata un'infezione facilmente curabile, in alcuni casi i sintomi prolungati possono avere un impatto significativo sulla qualità di vita.

Il trofozoita è lo stadio causa della sintomatologia, la quale a sua volta dipende dalla complessità dell’interazione tra Giardia e i suoi ospiti.

I sintomi ricorrenti possono derivare da una nuova infezione, dal fallimento del trattamento, da disturbi a livello della mucosa intestinale o da sindromi post-infezione.38

Cani e gatti infetti sono nella maggior parte dei casi asintomatici oppure possono presentare diarrea dovuta al malassorbimento, alla cattiva digestione, e all’aumento della motilità intestinale. 18 La diarrea può presentarsi con o senza sindrome da malassorbimento. 38

Gli animali giovani, immunodepressi e quelli che vivono in ambienti affollati sono a più rischio di mostrare segni clinici di malattia. 5

La diarrea, il più delle volte auto-limitante, che si verifica durante l'infezione sembra essere il risultato di una disfunzione della barriera epiteliale (alterazione delle tight junctions) che provoca malassorbimento di Na+ e glucosio e ipersecrezione di Cl-. Le feci di solito si presentano di aspetto mucoso, colore pallido, di consistenza ridotta e con un odore forte e può essere presente steatorrea. 37

In alcuni studi la prevalenza dell’infezione non ha mostrato alcuna relazione con la presenza o meno di segni clinici. 45, 46

In uno studio del 2001 svolto in Canada, dei 190 campioni di feci diarroiche solo 18 (9,5%) sono risultati positivi per Giardia al kit ELISA e confermati con la microscopia, confermando il fatto che la maggior parte delle infezioni è asintomatica. 47

Un altro studio svolto a Londra più recentemente ha confermato la mancanza di associazione tra la consistenza delle feci (diarrea) e l’infezione, infatti più della metà

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dei campioni positivi sono stati valutati di grado 2 (feci ben conformate), secondo una scala da 1 a 5 in cui il valore massimo corrispondeva a feci diarroiche. 48

Il protozoo non è entero-invasivo, e perciò il rilevamento di sangue nelle feci è raro. La maggior parte dei gatti e cani infetti sono afebbrili, non presentano vomito, e mostrano concentrazioni di proteine sieriche totali e valori di emocromo completo all'interno dei limiti di riferimento. Non è però noto se differenti assemblaggi possano indurre una diversa gamma di gravità dei segni clinici negli animali colpiti. 5

La presenza di malattie immunosoppressive o co-infezioni può determinare la comparsa e la gravità dei segni clinici della malattia.

Quando vengono rilevate anomalie agli esami di laboratorio, le alterazioni non sono patognomoniche per la giardiasi, ma generalmente riflettono solo la disidratazione e la perdita gastrointestinale di elettroliti se la diarrea è grave. La radiografia addominale può rivelare una maggiore presenza di aria e aumento della densità dei tessuti molli per la presenza di liquido nell’intestino. 5

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Diagnosi

G. duodenalis è stato descritto come "uno dei parassiti più comunemente mal

diagnosticato, sotto diagnosticato e sovra diagnosticato nella pratica veterinaria quotidiana". 11Anche quando responsabile di sintomatologia clinica, la diagnosi diretta o diagnosi eziologica rappresenta una sfida.

Considerata la diversità di forme con cui si può presentare e la numerosità delle cause responsabili di diarrea, i sintomi clinici non sono indicativi di giardiasi. I test principali per la diagnosi di Giardia includono lo striscio a fresco, la flottazione fecale per la ricerca delle cisti, i test di centrifugazione - flottazione fecale, i test di immunofluorescenza (IFA), l'individuazione degli antigeni fecali con test immunoenzimatici (ELISA) e la PCR. Questi test possono essere usati da soli o in combinazione tra loro. La sensibilità varia a seconda del metodo utilizzato e dell'esperienza del personale che svolge l'analisi.37,39

Considerato che le cisti di Giardia possono essere emesse in modo intermittente, sono necessarie analisi delle feci ripetute. Inoltre c’è da considerare che in alcuni casi le cisti possono alterarsi una volta venute a contatto con la soluzione flottante.49

Tra i diversi metodi diagnostici e nonostante un affinamento delle tecniche diagnostiche nel corso del tempo, non esiste un test che abbia una sensibilità del 100%. Ancora più problematica è la mancanza di un test ad alto valore predittivo positivo per la giardiasi clinica, e questo problema nasce dall’elevata prevalenza di infezione in animali clinicamente sani.

Di seguito vengono riportati i principali metodi diagnostici utilizzati nella pratica di laboratorio.

Striscio a fresco: una piccola quantità di feci diarroiche fresche viene mescolata con due o tre gocce di soluzione fisiologica su un vetrino e ricoperta con un vetrino copri oggetto. Con questa tecnica possiamo osservare cisti e trofozoiti, questi ultimi a 100x si riconoscono per i loro rapidi movimenti, ma le caratteristiche strutturali dovrebbero essere osservate a 400x o utilizzando la microscopia ottica. Raramente però i trofozoiti si ritrovano nelle feci ben conformate perché la loro sede definitiva è il tratto

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intestinale e solo grazie ad una peristalsi esagerata, che implicherebbe la presenza di diarrea, li ritroviamo nelle feci. I trofozoiti, quindi, possono essere visualizzati nello striscio fecale a fresco se il campione è prelevato direttamente dal retto e si tratta di un campione diarroico. 11

Un campione refrigerato o un esame eseguito diverse ore dopo la raccolta, non permette di mettere in evidenza trofozoiti vivi. 5 Le feci devono infatti essere esaminate entro 30 minuti dalla raccolta. L'applicazione di soluzioni come Lugol o blu di metilene, nonostante inattivino il parassita, aiutano nella visualizzazione delle strutture interne dei trofozoiti. 5

Flottazione fecale con tecniche di concentrazione: nei campioni non diarroici le cisti possono essere evidenziate più facilmente previa concentrazione, generalmente tramite centrifugazione con soluzione di zinco solfato.

I campioni possono essere conservati ad una temperatura di 4 °C per diversi giorni, ma non devono essere congelati. Se le feci contengono molto grasso la tecnica migliore per rilevarle è la sedimentazione con formalina-etilacetato.

Mentre i campioni di feci umane sono spesso fissati in formalina o poli-vinil alcool (PVA) prima dell’invio al laboratorio, i campioni canini e felini sono ancora regolarmente esaminati a fresco. 18

In medicina veterinaria, la centrifugazione con solfato di zinco è considerata la tecnica migliore per l'identificazione microscopica delle cisti di Giardia, con una specificità del 100%. A causa della eliminazione intermittente delle cisti, la sensibilità di questa procedura è del 70% quando viene valutato un singolo campione e aumenta fino al 95% se almeno 3 campioni fecali sono esaminati in 5 giorni consecutivi. 37

La tecnica prevede di mescolare 1-5 gr di feci e 10 ml di soluzione flottante (ZnSO4), versare in una provetta da centrifuga da 15 ml creando un menisco sul quale si andrà a posizionare il vetrino coprioggetto. Centrifugare per 5 minuti a 1500/2000 rpm. 50

ELISA: esistono diversi Kit disponibili per il rilevamento degli antigeni fecali di Giardia

duodenalis. I risultati ottenuti variano molto tra i diversi kit e se si vanno a comparare

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utilizzato (Prospect Giardia Rapid Assay, Remel, Lenexa,KS) ha avuto un tasso di falsi negativi del 31,6% rispetto alla centrifugazione con zinco solfato. 51

Al contrario, un altro studio in cui sono stati messi a confronto la flottazione con cloruro di zinco - cloruro di sodio (ZnCl2 - NaCl) e un kit ELISA (Prospect Giardia Microplate Assay, Remel, Lenexa, KS), ha evidenziato tassi di prevalenza del 9,5% (25 di 270) nei cani e 0% nei gatti (0 di 100 gatti) per quanto riguarda l'esame microscopico e del 29,5% (79 su 270) nel cane e 22% (22 100) nei gatti con il kit ELISA. La discrepanza dei risultati di questo studio con altri potrebbe essere attribuito all'uso di ZnCl2-NaCl

invece del solfato di zinco, che può alterare o distruggere le cisti, rendendo in tal modo il rilevamento microscopico difficile. 52

Un lavoro del 2013 ha esaminato 143 campioni fecali di cane utilizzando il kit ELISA SNAP Giardia test kit (IDEXX Laboratories, Milan, Italy), e il kit ha mostrato una sensibilità dell'88,9% e una specificità del 95,8%, con valore predittivo positivo di 89,6% e negativo del 95,4%. 53 I principali vantaggi dell’ELISA per la diagnosi della giardiasi canina sono la rapidità, il basso costo, e l’impiego di procedure semplici senza necessità di attrezzature speciali. 53

La tecnologia del test ELISA prevede l’uso di anticorpi specifici contro le proteine di parete delle cisti di Giardia rilasciate nelle feci durante il processo di incistamento. 11 Il Companion Animal Parasite Council (CAPC) attualmente raccomanda che i test che sfruttano gli antigeni fecali (ELISA) dovrebbero essere utilizzati insieme alla flottazione fecale o allo striscio diretto, soprattutto se questi ultimi sono risultati negativi, solo per la valutazione di cani e gatti con diarrea, intermittente o profusa, e non in animali clinicamente sani. (Companion Animal Parasite Council. 2010)

Immunofluorescenza Diretta: test basato sull’utilizzo di anticorpi marcati per rilevare cisti di Giardia e oocisti di Cryptosporidium. È necessario un microscopio a fluorescenza per leggere i risultati e se i campioni non possono essere esaminati immediatamente possono essere conservati a 4 °C massimo per qualche giorno, ma non dovrebbero essere congelati.

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Nell’uomo sono anche consigliate altre tecniche diagnostiche quali l’esame endoscopico con eventuale biopsia o l’esame microscopico dell’aspirato duodenale.

Tecniche Molecolari Genetiche: l'introduzione di tecniche molecolari, in particolare quelle basate sull'amplificazione in vitro degli acidi nucleici, ha rivoluzionato lo studio della epidemiologia della giardiasi. La PCR viene utilizzata sia a scopi diagnostici che per identificare i vari assemblaggi.

Diversi geni sono stati utilizzati per l’amplificazione del DNA, tuttavia i risultati di alcuni studi hanno mostrato che l’assegnazione degli isolati a specifici assemblaggi di

G. duodenalis non sempre è coerente perché geni sostitutivi possono dare risultati

diversi. 54

Ad esempio un isolato può essere genotipizzato come “potenzialmente zoonotico” in base ad un determinato gene o “ospite specifico” in base ad un altro. Un altro problema è che i primers disponibili non sempre amplificano il DNA di G. duodenalis. A volte i singoli isolati possono essere amplificati in un locus, ma non in un altro.

Per la ricerca di Giardia spesso si preferisce usare la nested PCR, che ha specificità e sensibilità maggiori. Questo è stato dimostrato in diversi studi, tra cui anche un lavoro del 2007 di Miller et al., in cui questo protocollo si è dimostrato molto sensibile anche con un basso numero di cisti di G. duodenalis. I risultati di amplificazione sono stati i seguenti: 100% per 10, 7, 5 e 4 cisti; 94% per 3 cisti; 90% per 2 cisti; e 80% nel caso di una sola cisti. 55

Si tratta di una variante della PCR tradizionale destinata a ridurre o a eliminare eventuali prodotti aspecifici, non desiderati, in seguito all’amplificazione di siti di legame di primers inaspettati (primers che possono legarsi a regioni di DNA non corrette). In questo modo, si viene ad aumentare la resa e la specificità di PCR particolarmente difficili. La PCR nested consiste nello utilizzo di due coppie di primers, una esterna che genera un normale prodotto di PCR ed una coppia con primers all’interno del prodotto amplificato. Se il prodotto di amplificazione fosse aspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine.

I primers utilizzati per l’identificazione dei diversi assemblaggi sono stati: 18S rRNA, glutammato deidrogenasi (gdh), fattore di allungamento 1-alfa (el1-a), trioso-fosfato isomerasi (tpi) (Monis et al., 1999), ß-giardina (Lalle et al., 2005).

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Tuttavia per la natura multi copia del gene 18S rRNA, la PCR che ha come target questo locus ha una più alta sensibilità ed è spesso usata per il rilevamento di Giardia da diverse matrici (feci ad esempio, umane e animali, campioni di acqua). 19

Tra i diversi metodi di genotipizzazione attualmente utilizzati in G. duodenalis, l’analisi multi-loci è quello più preciso, ma con ciclo più lungo e alto costo (Ryan e Cacciò, 2013).

In un recente studio del 2016 (Tan et all.) sono stati messi in evidenza i vantaggi del metodo PCR-RFLP, che non richiede attrezzature speciali, ma strumenti disponibili in quasi tutti i laboratori molecolari. Tutti i campioni inclusi nello studio (n=21) sono stati tipizzati con il metodo PCR-RFLP e i risultati si sono dimostrati in accordo con la genotipizzazione tramite HMR e il sequenziamento. Si è così concluso che la PCR-RFLP è veloce, facile e accurata per la tipizzazione di G. duodenalis, capace di distinguere in modo efficace gli assemblaggi zoonotici da quelli ospite-specifici. 58

La PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) si basa sul fatto che la regione di DNA di interesse contiene dei polimorfismi nucleotidici in siti riconosciuti da determinati enzimi di restrizione. Lo stampo di DNA viene amplificato tramite PCR e trattato con un enzima di restrizione. Questa reazione genererà dei frammenti di DNA il cui numero e le cui dimensioni dipenderanno dalla posizione dei siti di restrizione sullo stampo originale e le zone in cui sono presenti SPN (polimorfismi nucleotidici) verranno digerite in maniera diversa. Perciò quando la regione di DNA in questione viene tagliata con lo stesso enzima di restrizione e i frammenti separati tramite elettroforesi si genereranno due diversi profili di restrizione. 59

I risultati di queste tecniche molecolari possono, in alcuni casi, risultare falsamente negativi per la presenza di inibitori della PCR nelle feci e quindi non dovrebbe essere usato come unico mezzo di conferma di infezione.

La PCR potrebbe essere considerata per determinare l’assemblaggio di G. duodenalis soprattutto se il proprietario è preoccupato riguardo la possibile trasmissione zoonotica dell’infezione. 5

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Terapia

Poiché la giardiasi è difficile da eliminare, l'obiettivo primario del trattamento è quello di risolvere la diarrea.

Tutti gli animali con sintomatologia diarroica che presentano un test ELISA o flottazione fecale positivi per Giardia dovrebbero essere trattati, e dovrebbero essere lavati l’ultimo giorno di trattamento, per allontanare le eventuali cisti accidentalmente presenti sul mantello. 11

In medicina umana, una combinazione tra intervento nutrizionale e fitoterapia è spesso associata al trattamento farmacologico, con metronidazolo o tinidazolo, per trattare la giardiasi sintomatica.

Gli scopi principali dell’intervento nutrizionale sono quelli di ridurre la sintomatologia acuta della giardiasi, promuovere i meccanismi di difesa dell’ospite e inibire la crescita e la replicazione dei trofozoiti. Questi obiettivi possono essere raggiunti consumando cibi integrali, ad alto contenuto di fibre, basso contenuto di grassi e carboidrati. Anche l’assunzione di germe di grano e probiotici aiutano nella clearance del parassita. Per quanto riguarda gli interventi fitoterapici le piante più utilizzate sono Allium sativa,

Piper longum, piante contenenti flavonoidi e il propoli. 60

In medicina veterinaria, gli interventi nutrizionali sono spesso associati all’utilizzo di farmaci antiprotozoari. Nonostante non ci sia un farmaco veterinario specifico riconosciuto per il trattamento della giardiasi, molti sono efficaci nel diminuire il numero di trofozoiti. I farmaci della classe dei nitroimidazolici hanno effetti

anti-Giardia. 5

I farmaci con attività antiprotozoaria quali fenbendazolo e metronidazolo sono raccomandati per il trattamento della giardiasi, tuttavia, non mostrano un’efficacia del 100% e non sono in grado di controllare le infezioni batteriche secondarie che si verificano regolarmente.

Il fenbendazolo, l’anti-elmintico benzimidazolico più comunemente usato, agisce legandosi all’alfa-tubulina del citoscheletro dei trofozoiti il metabolismo energetico dei quali è di conseguenza diminuito a causa della mancanza di uptake di glucosio. Barr et all. nel 1994 e successivamente nel 1998 Zajack et al. hanno pubblicato dei lavori in cui viene valutata l’efficacia del fenbendazolo. In particolare nello studio di Barr et al. 12

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cani sono stati divisi in due gruppi e soggetti a due diversi tipi di trattamento in base al numero di somministrazioni effettuate, entrambi i gruppi si sono negativizzati all’esame delle feci (concentrazione con zinco solfato) dopo il trattamento, intendendo appunto per negativizzazione l’assenza di cisti alla flottazione. 61 Nello studio di Zajack et al. 20 cani sono stati divisi in due gruppi, uno trattato e l’altro no. Sono stati eseguiti 12 esami delle feci nei 25 giorni post- trattamento e 9 cani su 10 trattati con fenbendazolo (50 mg/kg SID, per OS per 3 giorni) sono sempre risultati negativi, mentre un solo cane è risultato positivo ad una flottazione per la presenza di cisti.62 Un beneficio addizionale nell'uso di questo farmaco è la sua efficacia anche nei confronti delle infestazioni da nematodi eventualmente presenti nello stesso animale. Il CAPC raccomanda la somministrazione di fenbendazolo al dosaggio di 50mg/kg, una volta al giorno , per 5 giorni sia nei gatti che nei cani oppure una combinazione sempre allo stesso dosaggio di fenbendazolo e metronidazolo (25mg/kg, ogni 12 ore, per 5 giorni). Per limitare le possibili reinfezioni, alla fine del trattamento è anche consigliato il lavaggio degli animali. Se il trattamento e il lavaggio degli animali non sono in grado di eliminare l'infezione (persistenza delle cisti nelle feci), il trattamento può essere prolungato per altri 10 giorni. 50

Altri benzimidazolici efficaci per il trattamento della giardiasi sono l' albendazolo, l'oxfendazolo e il febantel. L'uso dell’albendazolo non è però raccomandato nel cane e nel gatto a causa degli effetti di soppressione sul midollo osseo in questi animali. 63

La dose ottimale e la durata del trattamento con il metronidazolo quando usato per il trattamento della giardiasi clinica è sconosciuta. La CAPC suggerisce una dose massima di 25mg/kg, per via orale (PO), 2 volte al giorno per 5 giorni. (Companion Animal Parasite Council, 2010.) Per terapie superiori ai 7 giorni non si dovrebbe mai superare il dosaggio di 30mg/kg al giorno. In veterinaria spesso si utilizza il metronidazolo per il trattamento della giardiasi, il quale agisce legando covalentemente le molecole del DNA del parassita, provocando un danno irreversibile alle eliche, che ne causa la morte. Questo farmaco è una terapia efficace per la diarrea in cani e gatti indipendentemente dalla causa, e può essere chiaramente usato in combinazione con

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il fenbendazolo per alleviare i sintomi ed eliminare i parassiti, sebbene la dose utilizzata per l’eliminazione del parassita sia molto più elevata di quella usata di routine.

L'uso del metronidazolo e di altri nitroimidazoli ha anche il vantaggio di limitare le sovrapposizioni batteriche, che possono contribuire alla sintomatologia diarroica in alcuni soggetti. Tra questi, una combinazione di trattamento con ronidazolo, disinfezione dell'ambiente e shampoo dei cani trattati si è dimostrata altamente efficace nel ridurre l’escrezione di cisti di Giardia e può pertanto costituire una strategia di controllo alternativa nella giardiasi canina. 64

Una combinazione di febantel, pyrantel e praziquantel (compresse Drontal Plus®, Bayer, Shawnee Mission, KS), ha permesso di ottenere dei risultati incoraggianti nel trattamento della giardiasi in gatti e cani. Esistono però differenti formulazioni di questo farmaco e le differenze nel dosaggio potrebbero essere responsabili di alcune discrepanze tra i risultati degli studi di efficacia. In un report del 2009 che coinvolgeva sette cani infetti da Giardia e trattati con le compresse Drontal Flavour Plus (Febantel 150 mg, Pyrantel Pamoato 144 mg, Praziquantel 50 mg), SID per 3 giorni consecutivi si è riusciti a fermare l’eliminazione delle cisti per i primi tre giorni dopo il trattamento. A partire dal sesto giorno, però, si è potuto osservare un aumento dei cani che eliminavano le cisti e un aumento anche del numero di cisti eliminate. Non è possibile escludere una reinfezione, visto che il periodo prepatente può essere anche molto breve, fino a 5 giorni. 65

Un altro studio del 2008 effettuato in Spagna ha utilizzato il Drontal Flavour Plus per trattare 16 cani, suddividendoli in due gruppi, il primo trattato per 3 giorni alla dose raccomandata e il secondo per 5 giorni. Altri 8 cani sono stati presi come gruppo di controllo. Sono stati eseguiti esami coprologici prima dell’inizio del trattamento e 5,7,9 e 11 giorni post trattamento. Le cisti di Giardia non sono state rilevate nelle feci di sei degli otto cani appartenenti al primo gruppo e di cinque dei cani del secondo gruppo. L'efficacia del trattamento per cinque giorni consecutivi non si è rivelata statisticamente migliore di un trattamento per tre giorni consecutivi.66

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Nonostante manchino studi controllo negli animali domestici, altre terapie di supporto, incluse le fibre, la silimarina e i probiotici, sono stati somministrati ad alcuni gatti e cani con giardiasi sulla base di studi effettuati su altre specie. 5

L’aggiunta di fibre insolubili è stata proposta per diminuire l’aderenza dei trofozoiti e la colonizzazione dei microvilli, grazie alla maggiore secrezione di muco e all’aumentata peristalsi indotta dalle fibre. 67

Il trattamento probiotico può eventualmente ridurre i sintomi o l'intensità dell’infezione causati rispettivamente da una alterazione della flora microbica indotta dal parassita e dalla mancata competizione tra la flora microbica e il protozoo (per i siti di adesione, per i nutrienti). I probiotici possono anche produrre sostanze ad azione anti-Giardia e contribuire a migliorare le difese immunitarie dell’ospite.39, 68

Anche se alcuni dati, in gran parte provenienti da studi svolti sui topi, indicano che la somministrazione di probiotici possa ridurre l’ infezione da parte di Giardia 69, studi sul trattamento probiotico di cani naturalmente infetti, non hanno dimostrato alcun effetto sulla riduzione nell’eliminazione delle cisti. La principale causa della discordanza tra questi risultati può essere dovuta al fatto che i topi dello studio precedente sono stati trattati con il probiotico per diverse settimane prima dell’inoculazione sperimentale con Giardia, mentre i cani oggetto del secondo studio avevano una preesistente infezione acquisita naturalmente prima della somministrazione del probiotico. Così, anche se l'infezione può essere limitata con i probiotici, in competizione con i siti di aderenza enterici e grazie alla creazione di un ambiente enterico meno favorevole per la colonizzazione da parte di Giardia, questi possono essere meno efficaci nel trattamento di un’infezione preesistente. 70

La silimarina in aggiunta al trattamento con metronidazolo ha aiutato a compensare la perdita di peso e ad aumentare le proteine seriche totali e l'albumina rispetto ai cani a cui era stato somministrato solo metronidazolo. 71

La silimarina è una miscela di flavonoidi e fenilpropanoidi isolata dall’estratto del cardo mariano, pianta officinale scientificamente nota come Silybum marianum. È utilizzata per il trattamento di epatopatie per il suo potere epatoprotettore, è un potente antiossidante, antinfiammatorio e anti-fibrogenetico.

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Nel lavoro di Chon et al. pubblicato nel 2005, 28 cani asintomatici, risultati positivi alla flottazione con Zinco Solfato e allo SNAP test, sono stati divisi in quattro gruppi da sette soggetti ciascuno, il gruppo A è stato trattato solo con silimarina alla dose di 3,5 mg/kg, OS SID per 14 gg, il gruppo B è stato trattato con metronidazolo alla dose di 50 mg/kg OS SID per 14 gg, il gruppo C è stato trattato con metronidazolo + silimarina con le stesse dosi sopra citate. Il gruppo D era il gruppo di controllo, con soggetti non trattati. Le feci sono state esaminate tre volte a settimana per due settimane. Dopo 14 giorni dall’inizio del trattamento tutti i cani appartenenti ai gruppi B e C si sono rivelati negativi a test Elisa e alla flottazione, senza nessuna differenza significativa tra i due gruppi, dunque la silimarina non ha nessun effetto diretto contro questo parassita. In questo studio però sono stati valutati anche altri parametri che hanno evidenziato interessanti risultati. Infatti ci sono differenze significative dei livelli di proteine sieriche totali e albumina tra il gruppo trattato con metronidazolo e quello trattato invece con metronidazolo + silimarina (P< 0,05 per le PT e P< 0,01 per l’ALB). I valori risultano essere inferiori nei cani del gruppo B (PT = 13,4±2,75 g/dl e ALB = 5,9±1,17 g/dl) rispetto a quelli del gruppo C (PT = 16,9±2,90 g/dl e ALB = 8,5±1,77 g/dl). 71

Nonostante non siano indicati shampoo specifici per lavare i cani l’ultimo giorno di trattamento, strategia applicata per eliminare le cisti che potrebbero essere presenti sul pelo soprattutto nella regione perianale, quelli più usati contengono clorexidina digluconato al 4%, lasciata agire per 5-7 minuti (Fiechter et al., 2012). Tuttavia la clorexidina non è specificatamente indicata per l’eliminazione delle cisti di Giardia anche se è l’unico prodotto disinfettante disponibile sotto forma di shampoo, ed è utilizzata anche per aumentare ulteriormente il livello di igiene, fattore fondamentale nella strategia di lotta alla giardiasi. 72

Il trattamento di G. duodenalis in cani e gatti sintomatici o subclinici, è fortemente raccomandato a causa del possibile rischio zoonotico.

Sfortunatamente ci sono molti casi di giardiasi umana e animale che non rispondono al trattamento; la reinfezione è la causa più comune del fallimento terapeutico.

La reinfezione è un’ipotesi plausibile a causa della elevata resistenza delle cisti nell’ambiente esterno (due mesi a 8 ° C; un mese a 21 ° C; resistenza parziale a - 13 ° C

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in due settimane) che determina una elevata possibilità di reinfezione subito dopo il trattamento se i cani vivono in ambienti contaminati. Non ci sono studi specifici a riguardo, però in diversi lavori che hanno valutato l’efficacia di diversi farmaci nel trattamento della giardiasi si è potuto notare come l’associazione del trattamento ad una accurata pulizia dell’ambiente in cui vivono i cani ha dato sicuramente risultati migliori. 61, 62, 73

Villeneuve et al. nel 2000 hanno valutato l’efficacia dell’oxfendazolo in tre canili e solo in uno di questi si è adottata una accurata disinfezione dell’ambiente con ipoclorito di sodio e composti quaternari di ammonio. I risultati ottenuti hanno dimostrato che nei canili non disinfettati l’efficacia del farmaco si è dimostrata solo parziale (diminuzione del numero di cisti escrete), mentre nel terzo c’è stata una totale scomparsa delle cisti all’esame delle feci. Questo studio sottolinea l'importanza nei cani del rischio di reinfezione con cisti in ambienti contaminati. 73

Considerata la possibilità di reinfezioni subito dopo il trattamento, prima di poter parlare di resistenza al trattamento è necessario valutare la possibilità di contatto degli animali trattati con altri animali infetti, con ambienti contaminati oppure, ancora, con cisti presenti sul loro stesso mantello. 11

Poiché lo stato immunitario dell’ospite è un fattore essenziale per il successo della terapia, la giardiasi nei giovani animali debilitati è certamente più complessa da eradicare rispetto agli animali adulti, in salute e ben nutriti. Inoltre quando gli animali si trovano in ambienti stressanti, come gli allevamenti o i negozi di animali, lo stress provoca un aggravamento del processo patologico, complica i tentativi di trattamento e condiziona negativamente la riuscita del trattamento stesso. 11

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Prevenzione

In ambienti controllati (allevamento o canile), dovrebbero essere impiegati quattro principali approcci per controllare la giardiasi: (1) la decontaminazione dell'ambiente, (2) l'uso di farmaci per il trattamento degli animali infetti, (3) pulizia del mantello dalle cisti, e (4) evitare la reintroduzione dell’infezione. 5

La disinfezione dell’ambiente può essere effettuata utilizzando ipoclorito di sodio all’1%, glutaraldeide al 2% o sali di ammonio quaternario. 22

Lasciare i disinfettanti sulle superfici contaminate per 5-20 minuti prima di risciacquare contribuisce a garantire l’inattivazione delle cisti. 74

Le cisti sono relativamente resistenti alla clorazione e i livelli di cloro nelle acque potabili sono inadeguati a inattivare le cisti, per cui i processi di filtrazione delle acque sono considerati barriere importanti per la rimozione delle cisti.

Le cisti di Giardia sono sensibili alla luce ultravioletta (UV), nonché al calore (vapore) e all’essiccamento.

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Secondo Capitolo

Le Enteropatie Croniche

Con il termine generico di enteropatia ci si riferisce ad un quadro clinico, di laboratorio e/o ecografico anomalo a carico dell’apparato gastroenterico.

Un’enteropatia si definisce cronica quando i sintomi clinici si presentano da più di tre settimane, in maniera persistente o intermittente. 76

Anche se il termine diarrea viene spesso usato erroneamente per indicare un’enteropatia, quest'ultima, invece, può essere caratterizzata anche da una sequela di altri sintomi clinici tra cui vomito, borborigmi, flatulenze, perdita di peso, nausea, appetito altalenate e dolore addominale.

Per definizione, la diarrea cronica non è auto-limitante ed è di solito necessaria una diagnosi eziologica o istopatologica al fine di consentire un trattamento specifico. 76 L’anamnesi e l'esame clinico sono passi cruciali per il raggiungimento di una diagnosi, e indagini di laboratorio quali esame emocromocitometrico, profilo biochimico, analisi delle urine e coprologico parassitario, devono essere eseguite prima di intraprendere test di laboratorio più specifici quali ecografie, endoscopie o biopsie per un’indagine istopatologica.

Un’enteropatia cronica viene diagnostica innanzitutto dopo l’esclusione di cause extraintestinali, tra cui quelle epatiche, renali, pancreatiche, squilibri elettrolitici come nel caso dell’ipercalcemia e l’ipoadrenocorticismo e malattie intestinali di altra origine, come nel caso di ostruzione meccanica da corpo estraneo, intussuscezione o masse intestinali.

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Figura 5: Approccio Diagnostico alla Diarrea Cronica

Da: Simpson KW, Jergens AE. Pitfalls and Progress in the Diagnosis and Management of Canine Inflammatory Bowel Disease. Vet Clin North Am - Small Anim Pract. 2011;41(2):381-398.

In molti casi, nel corso di enteropatie croniche non si identifica un agente eziologico ed in questi casi il clinico segue un percorso a step per individuare una possibile responsività alla dieta, agli antibiotici e in ultima analisi a terapie immunosoppressive. Queste ultime sono identificate con il termine di IBD (Inflammatory Bowel Disease), e ne esistono diverse varianti istologiche (linfoplasmacellulare, eosinofilica, neutrofilica, granulomatosa).

Cause note di infiammazione intestinale comprendono parassitosi (in particolare

Giardia duodenalis), infezioni batteriche e allergie alimentari e solo le infiammazioni

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La Sintomatologia Diarroica

Come già detto, sicuramente la diarrea è uno dei sintomi più caratteristici di una enteropatia cronica. Per diarrea si intende un aumento della frequenza di defecazione e/o aumento del volume delle feci e/o una diminuzione della loro consistenza. 78

Malattie del piccolo intestino provocano diarrea solo se il materiale in arrivo dall’ ileo supera la capacità di assorbimento del colon o provoca la secrezione di acqua da parte del colon. Mentre la diarrea indica che c'è un processo patologico a livello intestinale, la sua assenza non esclude una patologia a carico del piccolo intestino. Al contrario, una malattia a carico del grosso intestino comunemente provoca diarrea perché non c'è nulla distalmente ad esso in grado di riassorbire acqua. 76

Fondamentalmente esistono quattro principali meccanismi fisiopatologici che possono provocare la diarrea, anche se spesso più meccanismi sono coinvolti contemporaneamente.

Diarrea Di Tipo Osmotico: si instaura come conseguenza alla presenza nel lume

intestinale di una quantità eccessiva di soluti osmoticamente attivi. In seguito a malassorbimento le sostanze nutritive mal assorbite o mal digerite rimangono all’interno del lume e osmoticamente attraggono acqua. La ritenzione di cibo indigerito, inoltre, può portare ad alterazione della microflora intestinale e alla fermentazione dei carboidrati, aumentando ulteriormente il numero di particelle osmoticamente attive. Un esempio classico di questo tipo di diarrea è l’insufficienza pancreatica.

Diarrea Secretoria: è causata da un anomalo trasporto di ioni a livello delle cellule

epiteliali intestinali. Alcuni mediatori possono causare alterazione dell’cAMP (adenosina monofosfato ciclico), della cGMP (guanosina monofosfato ciclica), del calcio, delle protein-chinasi, che a loro volta causano una diminuzione nell’assorbimento di sodio e cloro o un aumento nella secrezione del cloro. 79

Tali mediatori includono ormoni enterici endogeni, neuropeptidi, prodotti di cellule infiammatorie, enterotossine batteriche, acidi grassi e acidi biliari.

36 Aumento Della Permeabilità Mucosale: un aumento della permeabilità della mucosa

provoca perdita di liquidi, elettroliti, proteine e globuli rossi nel lume intestinale. Un’enteropatia erosiva o ulcerativa, disordini infiammatori o neoplastici sono comuni cause di alterazioni della permeabilità mucosale.

Alterazione della Motilità: le due principali anomalie motorie in corso di quadri

infiammatori intestinali sono la soppressione delle contrazioni fasiche e la stimolazione, invece, delle contrazioni migranti giganti. Si tratta di potenti contrazioni propulsive che si propagano ininterrottamente dal punto della loro origine, nel piccolo intestino, fino alla parte terminale dell’ileo e al colon. 80

La stimolazione di questo tipo di contrazioni provoca un transito ultrarapido delle secrezioni intestinali, pancreatico-biliari e del cibo indigerito, che arrivano al colon aumentandone il carico osmotico, con conseguente diarrea. Il fattore attivante le piastrine (PAF) può essere uno dei mediatori dell’infiammazione che stimola le contrazioni migranti giganti, ed è sintetizzato da polimorfo nucleati, leucociti, monociti, macrofagi, mastociti e eosinofili. 81

In caso di diarrea cronica è opportuno riuscire a stabilire se l’interessamento riguarda il piccolo o il grosso intestino. Volume e frequenza delle defecazioni così come il vomito di solito non sono utili nel fare questa distinzione. La perdita di peso, l’ematochezia, e il muco fecale sono criteri più affidabili.

Il piccolo intestino ha il compito di assorbire le sostanze nutritive, pertanto, la perdita di peso corporeo e/o l’abbattimento sono condizioni attese quando questo è cronicamente coinvolto. In questi pazienti la steatorrea è infrequente e la melena decisamente rara.

L'intestino crasso, invece, ha il compito di riassorbire l’acqua e agisce come un serbatoio per le feci fino al momento della defecazione, pertanto, la perdita di peso è rara in questi casi a meno che la malattia non sia molto grave e , in tal caso, ematochezia e muco nelle feci sono tipici; sono invece rari quando la patologia del colon è da lieve a moderata. 76

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Figura 6: Differenziazione tra la Diarrea del Piccolo e Grosso Intestino.