Composti chimici
Tutti i composti utilizzati durante gli esperimenti sono stati acquistati da Sigma – Aldrich, Milano, eccetto i casi specificati.
Analisi microbiologiche Culture dependent Terreni di coltura
La coltivazione dei microrganismi ha richiesto l’utilizzo di terreni di coltura specifici, con diverse caratteristiche, sterilizzati in autoclave alla temperatura di 120°C per 20 minuti, ad 1 Atm di pressione.
Le quantità riportate di seguito si riferiscono alla preparazione di 1L di terreno di coltura.
Terreno Luria Bertani (LB)
E’ stato preparato sia agarizzato che in fase liquida.
Triptone 10,0 g
NaCl 10,0 g
Yeast extract 5,0 g
Agar (Oxoid, Milano) 15,0 g
H2O deionizzata fino a 1 L
Terreno minimo Basal Salt Medium
Na2HPO4 2,2 g
KH2PO4 0,8 g
NH4NO3 3 g
47 Fonti di carbonio per Basal Salt Medium
Le fonti di carbonio sono state fornite aggiungendo al terreno minimo gasolio alla concentrazione dello 1% v/v, di cui si vuole valutare la degradazione e latte in polvere al 2% p/v. L’aggiunta delle fonti di carbonio è avvenuta in condizioni di sterilità, successivamente al passaggio in autoclave del Basal Salt Medium.
Soluzione fisiologica
La composizione della soluzione fisiologica è la seguente:
NaCl 0,90 g / L
Si sterilizza in autoclave per 20 minuti alla temperatura di 121°C, ad 1 Atm di pressione.
Isolamento dei ceppi microbici capaci di utilizzare gasolio come unica fonte di carbonio
Ceppi batterici autoctoni dei sedimenti, in grado di utilizzare gasolio come unica fonte di carbonio sono, stati isolati da 1 g di sedimento incubato in 100 ml di Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v. L’incubazione è stata mantenuta al buio per 15 giorni su un agitatore rotante (250 rpm) a temperatura ambiente. Al termine dei 15 giorni, un aliquota di 1 ml è stata trasferita in Basal Salt Medium fresco preparato come sopra. Tale procedimento è stato ripetuto per 5 cicli al termine dei quali diluizioni seriali di aliquote della coltura microbica di arricchimento sono state piastrate su terreno LB agarizzato per isolare in coltura axenica i ceppi batterici cresciuti in coltura di arricchimento perché in grado di utilizzare il gasolio come unica fonte di carbonio per la crescita.
Le piastre di LB sono state incubate per 72 ore in camera umida alla temperatura di 25°C e le colonie formatisi sono state distinte in base al loro morfotipo.
48 Conta microbica
La crescita microbica è stata misurata mediante diluizioni seriali dei morfotipi cresciuti in coltura axenica ed in consorzio microbico in LB overnight e successivamente inoculati in Basal Salt Medium addizionato di gasolio 1% v/v, mezzo di crescita in cui si voleva valutare la capacità di crescita del candidato batterico. L’inoculo in Basal Salt Medium, è stato effettuato con colture batteriche con una OD (Optical Density) a 600 nm allo spettrofotometro SPECTROstar Nano BMG LABTECH, pari a 0,01 unità. Al tempo zero (T0), dopo tre giorni di incubazione (T3) e dopo 6 giorni di incubazione (T6), sono state preparate diluizioni seriali della sospensione batterica in acqua fisiologica. Le diluizioni seriali sono state piastrate su LB agarizzato. Per ogni tempo di analisi sono state seminate tre piastre. Le piastre sono state incubate per 24 – 48 ore in camera umida alla temperatura di 28°C. Dopo l’incubazione sono state contate le unità formanti colonia, Colony Forming Unit, CFU, delle repliche per ogni diluizione eseguita ed è quindi stata calcolata la media dei valori ottenuti.
Prove di degradazione del gasolio in Basal Salt Medium
La valutazione della capacità di degradazione del gasolio a carico dei morfotipi in coltura axenica ed in consorzio è stata valutata in Basal Salt Medium addizionato di gasolio 1% v/v come unica fonte di carbonio. E’ stata valutata inoltre la capacità di degradazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio 1% v/v e latte in polvere per bovini al 2% p/v.
Sono state preparate tre beute da 15 ml contenenti 10 ml di Basal Salt Medium per ogni tempo di analisi, e per ogni tempo di analisi le beute sono state sacrificate come replicati indipendenti ed analizzati alla GC - MS.
49 Procedure chimiche analitiche per la determinazione dell’attività di degradazione dei ceppi isolati
Definizioni
DROs: Diesel Range Organics ( composti organici dell’intervallo del gasolio).
Tempo di ritenzione: il tempo che impiega un composto ad eluire dalla colonna analitica al rivelatore, partendo da un tempo zero che corrisponde all’inizio della rampa di temperatura del gascromatografo.
Metodo dello standard interno: metodo attraverso il quale la concentrazione dell’analita viene determinata confrontando l’area dei picchi determinati tramite l’analisi in GC - MS del campione, con l’area di uno o più standard a concentrazione nota. La determinazione si ottiene mediante una curva di taratura.
Di seguito è descritto il procedimento del metodo di analisi di substrati solidi come il sedimento in esame, contaminato da idrocarburi DROs mediante cromatografia associata ad un detector a ionizzazione di fiamma.
Metodo di analisi di substrati solidi
L’analisi degli idrocarburi nei campioni sperimentali è stata effettuata mediante Gascromatografia associata alla spettrometria di massa.
Ai campioni in analisi, che consistono nella sospensione batterica in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v, sono stati aggiunti gli standard interni deuterati: C16 e C24 2µg ciascuno. Sono state effettuate tre partizioni con diclorometano saturo di acqua (rapporto 1:1/3 vol/vol). I campioni sono stati portati a secco sotto vuoto con evaporatore rotante ed eluiti con 400µl di diclorometano ed infine raccolti in vials di vetro.
50 Identificazione e quantificazione
Le analisi dei campioni sono state eseguite con un gas cromatografo (CP-3800, Varian, Palo Alto, California, USA) accoppiato con spettrometro di massa (Saturn 2200, Varian, Palo Alto, California, USA) usando una colonna capillare MEGA-1MS (fase staz. 100% polidimetilsilossano, lunghezza 30mt, diametro interno 0,25mm, spessore film 0,25µm; MEGA s.n.c., Milano, Italia). I campioni derivatizzati (1µl) sono stati iniettati nella colonna capillare e sottoposti ad una rampa termica. Durante le analisi la temperatura del forno era mantenuta inizialmente a 50°C per 2 minuti a cui seguiva l’inizio di un gradiente termico con il seguente andamento: da 50°C a 300°C a 10°C min-1.
Il gas di trasporto era costituito da elio con un flusso di 1ml min-1, la temperatura della trappola ionica era fissata a 200°C. Le molecole erano ionizzate per impatto elettronico con un’emissione di corrente di 10 µA. L’acquisizione dello spettro di massa è stato ottenuto monitorando singoli ioni caratteristici (SIS) o mediante la riframmentazione di uno ione caratteristico più abbondante (MRM).
L’identificazione delle molecole è avvenuta sulla base del riconoscimento del picco prodotto dagli ioni caratteristici ottenuti dalla frammentazione della molecola, unito al tempo specifico di ritenzione in colonna. La quantificazione delle molecole è stata effettuata comparando l’area del picco di uno o più ioni caratteristici dello standard interno con quella ottenuta per gli analiti identificati. Il livello minimo di detection è stato monitorato quotidianamente mediante gli standard e il rapporto segnale/rumore.
Ioni caratteristici originati dalla frammentazione delle molecole analizzate
L’analisi alla gascromatografia produce degli ioni caratteristici. Gli ioni degli alcani sono:
57 um
71 um
51
Tutti gli alcani producono lo stesso spettro di massa con i suddetti ioni caratteristici. Lo standard interno produce ioni quali il 66, 82 e 98.
I cromatogrammi relativi ai campioni analizzati mostrano un picco non appartenente al profilo degli alcani lineari che la banca dati NIST Mass Spectra Database 2013 ha identificato come C18 metilestere. Gli ioni del metilestere sono:
297 um
266 um.
Preparazione del DNA genomico
Il DNA genomico, dei 9 morfotipi isolati dal consorzio microbico del sedimento in esame, è stato estratto e purificato utilizzando il kit “GenElute Bacterical Genomic
DNA” (Sigma - Aldrich). Gli isolati batterici sono stati messi in coltura in LB a 28°C in
agitatore orbitale per 24 ore. Il protocollo di estrazione del DNA genomico prevedeva di:
Prelevare 2 ml di sospensione batterica cresciuta in LB, centrifugare per 2 min a 13000 rpm a 4°C.
Sospendere il pellet, costituito da cellule batteriche, in 180 μl della “soluzione di
lisi T” e aggiungere 20 μl di RNase A (10 μg μl-1).
Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
Aggiungere 20 μl di Proteinasi K (20 mg ml-1), incubare la miscela a 55°C per 30 min.
Aggiungere 200 μl della “soluzione di lisi C”, e dopo aver agitato con il vortex la miscela, incubare a 55°C per 10 min.
Aggiungere 200 μl di etanolo 100%
Trasferire la miscela nel tubo eppendorf contenente un’apposita colonnina, precedentemente attivata con 500 μl di “soluzione di preparazione”.
Centrifugare per 1 minuto a 6500 rpm sia l’eppendorf che colonnina.
Trasferire la colonnina in un tubo eppendorf nuovo e aggiungere 500 μl di “soluzione di lavaggio 1” e centrifugare a 6500 rpm per 1 minuto.
52 Aggiungere 500 μl di “soluzione di lavaggio concentrata” e centrifugare a 6500
rpm per 3 minuti.
Trasferire la colonna in un nuovo tubo Eppendorf ed eluire il DNA aggiungendo 50 μl di acqua sterile, incubare 1 minuto a temperatura ambiente e centrifugare a 13000 rpm per 1 minuto.
Ripetere l’eluizione aggiungendo 50 μl di acqua sterile, incubare 1 minuto a temperatura ambiente e centrifugare a 13000 rpm per 1 minuto.
Successivamente è stata determinata la concentrazione e la purezza del DNA estratto mediante letture spettrofotometriche a 260 e 280 nm. L’estratto genomico (100 ng di DNA) è stato controllato in relazione al peso molecolare su gel di agarosio all’1% in TAE, utilizzando il marcatore molecolare SharpMass TM DNA Ladder EuroClone.
Caratterizzazione tassonomica dei ceppi isolati
La caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati è stata eseguita tramite amplificazione del gene 16 S rDNA mediante primer 27f e 1492r (Muyzer et al., 1993) (Tabella 6). Il prodotto di PCR è stato analizzato mediante Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) come segue.
ARDRA: Amplified Ribosomal DNA restriction Analysis
Il prodotto di amplificazione del gene 16 S rDNA è stato analizzato utilizzando gli enzimi di restrizione Sau 3A , Alu I e Hae 3 (Tabella 5). Il protocollo di esecuzione è il seguente:
Reazione di PCR su colonia utilizzando i primer per il gene rDNA 16 S (27 f, 1492 r).
Digestione con enzimi di restrizione condotta su 100 μg di amplificato, buffer 10 x specifico per l’enzima e endonucleasi di restrizione 0,5 U.
Incubazione di 1 ora a 37°C.
Corsa elettroforetica su gel d’agarosio 2% in TAE utilizzando il marcatore molecolare SharpMass TM DNA Ladder EuroClone.
53 Osservazione dei profili di restrizione utilizzando un trans illuminatore Chemi DOC a raggi ultravioletti con una fotocamera digitale per acquisire l’immagine.
Enzima di restrizione Sequenza di DNA riconosciuta 5’ - 3’ Sau3A Alu I Hae 3 GATC AGCT GGCC
Tabella 5 Elenco degli enzimi di restrizione utilizzati per l'analisi ARDRA
I prodotti di PCR appartenenti alle diverse Operational Taxonomic Units OTU ottenute sono stati inviati alla di ditta PRIMM di Milano per acquisire la sequenza di 500 bp al 5’ del gene che codifica per il 16S rDNA corrispondente. A tale scopo è stato utilizzato il primer 27f (Tabella 6).
Primer Sequenza di DNA riconosciuta 5’ - 3’
Specificità
27 f Forward AGAGTTTGATCMTGGCTCAG Primer forward utilizzato per l’amplificazione del gene 16 S rDNA(Muyzer et
al., 1993) .
1492 r Reverse GGTTACCTTGTTACGACTT Primer reverse utilizzato per l’amplificazione del gene 16 S rDNA (Muyzer et al., 1993)
54 Estrazione DNA delle comunità microbiche da sedimento
L’estrazione del DNA delle comunità microbiche dal sedimento è stata effettuata utilizzando il FastDNA® SPIN Kit, un kit che permette l’estrazione diretta di DNA dal sedimento basato sulla lisi meccanica con beads di silice e ceramica in un bead – beater (FastPrep® 24 Instruments), con una lisi efficiente di tutti i microrganismi. Il FastPrep® System combina il FastDNA® SPIN Kit for SOIL ed il FastPrep® 24 Instrument (FastPrep® FP 24 Instrument), il quale consiste in un agitatore caratterizzato da un movimento sussultorio con velocità molto elevate (4.0 – 6.5 m s–1); tale movimento, combinato con la presenza di beads di silice e ceramica di varie dimensioni nel tubo di lisi del kit associato, permette di lisare in modo efficiente tutti i microrganismi, anche quelli più resistenti alla lisi chimica ed enzimatica quali le endospore, le spore degli eubatteri, i batteri Gram positivi. Il protocollo di estrazione è il seguente:
Prelevare 500 mg di sedimento e aggiungerlo ai tubi con microsfere forniti nel kit.
aggiungere 978 µl di Buffer Sodio Fosfato e 122 µl di MT Buffer.
Omogeneizzare per 40 secondi a velocità 6 con FastPrep® Instrument.
Centrifugare per 5 -10 minuti a 14000 xg.
Trasferire il surnatante in eppendorf sterili da 2 ml e aggiungere 250 µl di PPS (Protein Precipitation Solution), seguito da agitazione manuale per circa 10 volte.
Centrifugare per 5 -10 minuti a 14000 xg per far precipitare il pellet e trasferire il surnatante in eppendorf sterile da 2 ml.
Risospendere la sospensione Matrix Binding e aggiungere 1 ml di surnatante in eppendorf da 2 ml; agitare a mano per 2 minuti in modo da consentire il legame de DNA.
Posizionare il tubo in un rack per 3 minuti per consentire l’assestamento della matrice.
Rimuovere ed eliminare 500 µl di surnatante facendo attenzione a non toccare le biglie e risospendere il surnatante residuo.
55 Trasferire circa 600 µl della miscela in tubo con filtro SPIN ™ e centrifugare a
14000 xg per 60 secondi.
Eliminare la sospensione dal tubo di raccolta e aggiungere 500 µl di SEWS – M, precedentemente preparato con aggiunta di etanolo al 70%, e risospendere delicatamente con il puntale di una pipetta.
centrifugare a 14000 xg per 60 secondi ed eliminare il residuo dal tubo di raccolta sostituendolo con un nuovo tubo (operazione ripetuta per due volte).
asciugare il filtro SPIN ™ a T.A. per 5 minuti e risospendere con 50 – 100 µl di DES (DNasi/ Pyrogen Free Water).
Centrifugare a 14000 xg per 1 minuto per fa precipitare il DNA eluito nel tubo di cattura pulito.
Effettuare una corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% per confermare l’avvenuta estrazione del DNA dal sedimento.
PCR: Polymerase Chain Reaction
1 μl di campione di DNA delle comunità microbiche del sedimento (250 ng) è stato amplificato mediante reazione di PCR utilizzando i primer descritti in tabella 7. La reazione è stata condotta utilizzando 50 pmol di ciascun primer, 5μl di Buffer 10x , 100 mM di dNTP, 0,5 μg Taq Polimerasi Eppendorf per un volume finale di 50 μl. I programmi di amplificazione sono stati eseguiti utilizzando un termociclatore modello MastercyclerR Family Eppendorf e sono descritti in Tabella 8.
Primer Sequenza 5’ – 3’ Specificità
27 f Forward 1492 r Reverse AGAGTTTGATCMTGGCTCAGTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT Primer universale per l’amplificazione
del gene 16 S rDNA (Lane, 1991a). Primer universale per l’amplificazione
del gene 16 S rDNA(Lane, 1991b)
56 AlkB f Forward AlkB r Reverse Alk f Forward Alk r Reverse RHOSE Forward RHOAS Reverse Alk-H1F Forward Alk-H3R Reverse GCICAIARITIRKICAYAA GCITGITGITCISWRTGICGYTG AAYCANGCNCAYGARCTNGGNCAY AA GCRTGRTGRTCNGARTGNCGYTG ACGGSCAYTTCTACRTCG CCGTAARTGYTCGAGRTA CIGIICACGAIITIGGICACAAGAAGG IGCITGITGATCIIIGTGICGCTGIAG Primer degenerati in uso combinato per
l’amplificazione e l’identificazione del gene alkB (Jurelevicius et al., 2012) p2 Forward p3 Reverse CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG CGGGGCACGGGGGGCCTACGGAGG CAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG Primer forward utilizzato per amplificare la regione V3 del gene
16 S rDNA (Muyzer
et al., 1993).
Primer reverse utilizzato per amplificare la regione V3 del gene
16 S rDNA (Muyzer
et al., 1993). Tabella 7 Elenco dei primer utilizzati nelle reazioni di PCR sia del gene 16s rDNA che del gene
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Reazione Primer Programma di
amplificazione
PCR eseguita per l'amplificazione del gene 16
S rDNA di 1500 bp
PCR eseguite per l'amplificazione del gene
alkB con primer degenerati
(Perez-de-Mora et al., 2011) 27 f 1492 r AlkB f AlkB r Alk f Alk r RHOSE f RHOAS r AlkH1 f 10 min a 95° C 40 cicli di: 45 sec a 95° C 49 sec a 50° C 2 min a 72° C 5 min a 72° C 10 min a 95° C 5 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 55° C 45 sec a 72° C 40 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 57° C 45 sec a 72° C 10 min a 95° C 5 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 45° C 45 sec a 72° C 40 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 57° C 45 sec a 72° C 10 min a 95° C 5 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 55° C 45 sec a 72° C 40 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 57° C 45 sec a 72° C 10 min a 95° C 5 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 60° C
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PCR eseguita per l’amplificazione della regione
ipervariabile V3 di 100bp del gene 16S rDNA (Muyzer et
al., 1993) AlkH3 r p2 f p3 r 45 sec a 72° C 40 cicli di: 45 sec a 95° C 60 sec a 57° C 45 sec a 72° C 5 min a 95° C 40 cicli di: 1 min a 95° C 1 min a 50° C 1 min a 72° C 5 min a 72° C
Tabella 8 Elenco dei programmi di PCR usati con le singole coppie di primer.
DGGE: Denaturing gradient gel electrophoresis
L’elettroforesi su gel in gradiente denaturante è stata eseguita per separare molecole di DNA che differiscono le une dalle altre per la loro sequenza nucleotidica. Questa tecnica è stata eseguita utilizzando lo strumento DCode System for DGGE Biorad. Il protocollo ha previsto:
Reazione di PCR utilizzando i primer specifici per la regione ipervariabile V3 per i batteri (p2, p3). Per ottenere una quantità di amplificato pari a 1 μg da caricare su gel di poliacrilammide, sono state effettuate mediamente 40 reazioni di PCR per campione.
Precipitazione prodotto di PCR:
Estrazione con Etanolo Estrazione con Isopropanolo. Preparare una mix contenente: Preparare una mix contenente: Prodotto di PCR Prodotto di PCR
Etanolo 100% 1:2,53 (vol/vol) Isopropanolo 1:1 (vol/vol) Sodio acetato 3 M pH 5,2 1:10(vol/vol) Sodio
acetato3M,pH5,21:10(vol/vol)
Centrifugare per 15 minuti a 14000 x g ed una temperatura di 4°C. Eliminare il sopranatante ed aggiungere 200 ml di etanolo 70% glaciale. Centrifugare per 15
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minuti a 14000 x g ad una temperatura di 4°C. Eliminare il sopranatante e lasciare asciugare il pellet da residui di etanolo sotto cappa.
Risospendere il pellet in 10 – 50 µl d’acqua sterile.
Quantificazione del prodotto di PCR:
Il prodotto di precipitazione viene visualizzato mediante un’elettroforesi su gel d’agarosio 2% in TAE; l’intensità della banda di DNA caricata viene confrontata con il marcatore molecolare SharpmassTM DNA Ladder (EuroClone).
Preparazione del gel di poliacrilammide con gradiente denaturante:
Lavare gli strumenti ed eliminare i residui di sapone con una soluzione di KOH 2% in etanolo 100%.
Preparare le soluzioni per la formazione del gradiente in falcon da 50 ml: Soluzione al 40%
Acrilammide 3,5 ml
TAE 50x 0,36 ml
Formammide 2,88 ml
Urea 3,03 g
H2O bidistillata fino a 18 ml
Soluzione al 60% Acrilammide 3,5 ml TAE 50x 0,36 ml Formammide 4,32 ml Urea 4,54 g Loading dye 6x 180 μl
H2O bidistillata fino a 18 ml
Aggiungere 9 μl di TEMED e 135 μl di APS 20% in H2O a ciascuna soluzione, invertire 4 – 5 volte per favorire la miscelazione evitando la formazione di gas. Caricare le soluzioni nelle apposite siringhe e sistemarle nel gradientatore (Biorad) il quale ha la funzione di generare un gel di poliacrilammide dotato di un gradiente lineare di denaturazione (30 – 60 %). Lasciar polimerizzare il gel a temperatura ambiente sotto la luce del neon per circa un’ora e mezzo.
Caricare il gel nella camera elettroforetica, precedentemente riempita con 7 L di tampone TAE 1% preriscaldato a 60 °C.
60 Caricare i campioni di DNA: 1 μg di DNA e 10 μl di Loading Dye Solution 6x per
un volume finale di 40 μl.
Settare il voltaggio e avviare la corsa elettroforetica mantenendo la temperatura di 60°C. L'analisi DGGE batterica e stata eseguita a 30 mV per 16 h, l'analisi fungina a 50 mV per 20 h.
Al termine della corsa liberare il gel di poliacrilammide ed immergerlo per 3 minuti in una bacinella con 250 ml di tampone TAE 1x e 25 μl di EtBr 100 mM per la colorazione.
Lavare il gel in 250 ml di tampone TAE 1x per 30 minuti.
Osservare il gel sotto la lampada UV irradiando il DNA con raggi ultravioletti per evidenziare le bande.
Fotografare con Chemi Doc per ottenere l’immagine in formato digitale.
Tagliare le bande di DNA d’interesse con una lametta sterile utilizzando una maschera UV, conservare le bande tagliate, in eppendorf da 1,5 ml, in congelatore a 20° C per successive analisi.
Eluizione delle bande DGGE dal gel di Poliacrilammide
Dopo l’analisi DGGE, le bande sono state tagliate dal gel di Poliacrilammide ed eluite in microtubi da 0,2 ml con 50 µl di H2O sterile, ad una temperatura di 37°C e in agitazione costante a 200 rpm.
Amplificazione del DNA eluito dal gel di Poliacrilammide
Il DNA eluito è stato successivamente amplificato utilizzando i primer p2 e p3 (Tabella 7) in modo tale da amplificare la regione V3 del gene 16 S rDNA.
Purificazione del prodotto di PCR
La purificazione del prodotto di PCR per il successivo sequenziamento viene utilizzata per rimuovere i primer utilizzati precedentemente nella reazione ed evitare di
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compromettere reazioni successive come il sequenziamento o una nuova PCR. La purificazione è stata eseguita utilizzando il kit NucleoSpinR Extract Macherey Nagel. Il protocollo di estrazione è il seguente:
Per 100 mg di gel di agarosio al 2% aggiungere 200 μl di Buffer NTI all’interno della eppendorf da 1,5 mL contenete il gel.
Incubare per 5 – 10 minuti a 50°C e agitare ogni 2 – 3 minuti fino al completo scioglimento del gel di agarosio.
Versare il contenuto della eppendorf in una colonna NucleoSpin® Gel e PCR Clean-up fino ad un volume di 700 μl ed unire ad un Collection Tube da 2 mL; Centrifugare per 1 minuto a 11000 xg.
Aggiungere 700 μl di Buffer NT3, precedentemente risospeso in 20 mL di etanolo assoluto, quindi centrifugare per 1 minuto a 11000 xg.
Spostare la colonna NucleoSpin® Gel e PCR Clean-up in un Collection Tube nuovo centrifugare nuovamente a 11000 xg per 2 minuti per essere sicuri di aver rimosso totalmente il Buffer NT3.
Spostare la colonna NucleoSpin® Gel e PCR Clean-up in un Collection Tube nuovo e aggiungere 15 μl di acqua sterile e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
Centrifugare a 11000 xg per 1 minuto per far precipitare il prodotto di PCR purificato.
Presentazione dei dati ed Analisi Statistica
I risultati sono stati presentati come media ± SEM (Standard Error of the Mean) di tre esperimenti indipendenti. L’analisi statistica per le differenze tra le medie è stata condotta mediante il metodo dell’analisi della varianza (T STUDENT per dati appaiati). Valori di p inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
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