Isolamento di ceppi microbici in grado di degradare gli idrocarburi
L’isolamento di batteri capaci di utilizzare il gasolio come unica fonte di carbonio ha condotto all’identificazione di 9 morfotipi che sono stati denominati: Con1, Con2, Con3, NM1, NM2, M1, M2, G1 e G2. I morfotipi sono stati propagati sia su terreno LB agarizzato che su terreno Basal Salt Medium in presenza di gasolio all’1% v/v. Successivamente ne è stata valutata la capacità degradativa sia in coltura axenica che in consorzio. In tabella 9 è riportata la crescita dei morfotipi in coltura axenica ed in consorzio nei diversi terreni minimi di crescita Basal Salt Medium addizionato di gasolio 1% v/v.
Morfotipi Crescita in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v Incremento CFU T6-T0 Consorzio Con 1 Con 2 Con 3 M1 M2 NM1 NM2 G1 G2 Si Si Si Non cresce Si Effetto batteriostatico Si Non cresce Si Si <10 <10 <10 Non cresce <10 <10 Non cresce <10 <10
63 Tabella 9 Crescita della componente batterica in funzione del tempo espressa come
incremento delle Unità formanti colonia tra il T6 e il T0.
In Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v la crescita microbica risulta essere lenta sia per i morfotipi in coltura axenica che in consorzio. I morfotipi Con 3 ed NM 2 non crescono nelle suddette condizioni colturali e per il morfotipo M2 si osserva un effetto della particolare condizione di crescita.
In Tabella 9 è indicata la crescita del consorzio microbico cresciuto in Basal Salt Medium addizionato di latte in polvere al 2% p/v e gasolio all’1% v/v dove il rapporto incrementale tra T6 e T0 tra le unità formanti colonia raggiunge i due ordini di grandezza, indicando un utilizzo da parte del consorzio batterico del latte come fonte alternativa di carbonio.
Analisi della capacità degradativa del consorzio microbico
La capacità degradativa nei confronti degli n-alcani dei morfotipi batterici in consorzio ,quando incubato in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v, è mostrata in Figura 10. La metodica adottata per le quantitative necessarie allo studio della degradazione degli alcani è la GC – MS.
La figura 10 mostra il decrescere della concentrazione degli n – alcani presenti nel gasolio durante i 6 giorni di incubazione del consorzio batterico in coltura liquida, dove n in Cn indica il numero di carboni del singolo alcano.
Consorzio
Crescita in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v e latte
2% p/v Si
64 Figura 10 Concentrazione degli n – alcani ai vari tempi di incubazione (T0, T3 e T6) in Basal
Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v in presenza dei morfotipi batterici in consorzio,dove n in Cn indica il numero di carboni del singolo alcano. Ogni istogramma
rappresenta la media ± SEM di 3 esperimenti. Significatività per valori con p<0,005 (T - student).
La percentuale di rimozione degli alcani al termine dell’incubazione al T6 è riportata in figura 11.
Figura 11 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium del consorzio microbico.
65
E’ possibile osservare che al termine dei sei giorni di incubazione ogni singolo alcano è stato degradato con percentuali che variano dall’83,83% al 98,54%.
In Figura 12 sono illustrati i cromatogrammi relativi alle corse in GC-MS dell’estratto del mezzo liquido relativo alla quantificazione dei C>12 presenti nel Basal Salt Medium ai diversi tempi di incubazione del consorzio (T0 – T6). Ad ogni picco corrisponde un n – alcano a diversi atomi di carbonio.
Figura 12 Cromatogrammi relativi al contenuto in idrocarburi ai successivi tempi di analisi (pannello superiore T0, pannello intermedio T3, pannello inferiore T6) del consorzio dei nove
morfotipi incubati in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v. Picco corrispondente ad un singolo alcano lineare
66
E’ possibile osservare, come nel corso dei vari tempi della sperimentazione, oltre ad una riduzione della concentrazione dei picchi corrispondenti ai singoli alcani lineari del gasolio, vi sia un appiattimento dell’area detta “spina di pesce” sottostante i picchi (ISPRA, 2011b). La cosiddetta “spina di pesce” corrisponde agli idrocarburi con numero di carboni maggiore di 12 quali isoalcani, cicloalcani, alchilbenzeni, alchilnaftaleni e idrocarburi policiclici aromatici che non sono risolti o separati in colonna durante una specifica corsa destinata alla separazione degli n- alcani (ISPRA, 2011b). Nel presente elaborato di tesi la spina di pesce sarà indicata come frazione idrocarburica non lineare C>12.
La percentuale di degradazione del totale degli n – alcani è riportata in tabella 10 ed è pari al 90,43%. La percentuale di degradazione degli idrocarburi non lineari C>12 è riportata in tabella 11 dove è indicata una percentuale di rimozione pari al 95%.
Tabella 10 Tabella riassuntiva delle percentuali di riduzione del totale degli alcani lineari in Basal Salt Medium addizionato con gasolio all’1% v/v in presenza dei morfotipi in coltura
axenica e del consorzio. Morfotipi in coltura
axenica e/o consorzio
% riduzione T6 Con 1 M1 M2 NM1 G1 G2
Consorzio in Basal Salt Medium addizionato di
gasolio all’1% v/v Consorzio in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v e latte al
2% p/v 67,01% 18,20% 17,91% 29,04% 26,60% 78,35% 90,43% 49,33%
67 Morfotipi in coltura axenica
e/o consorzio % riduzione T6 Con 1 Con 2 M1 M2 NM1 G1 G2
Consorzio in Basal Salt Medium addizionato di
gasolio all’1% v/v Consorzio in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v e latte al
2% p/v 10% 10% 46% 15% 50% 45% 20% 95% 85%
Tabella 11 Tabella riassuntiva delle percentuali di riduzione degli alcani non lineari C>12 in Basal Salt Medium ad opera dei diversi morfotipi in coltura axenica e del consorzio.
La capacità degradativa nei confronti degli n-alcani dei morfotipi batterici in consorzio, quando incubato in Basal Salt Medium addizionato di latte per bovini all’2% p/v e gasolio all’1% v/v, è mostrata in Figura 13, dove si osserva una diminuzione delle concentrazioni dei singoli alcani seppur inferiore a quella osservata in presenza di gasolio come unica fonte di carbonio. In figura 14 sono riportate le percentuali di degradazione per ogni n – alcano.
68 Figura 13 Concentrazione degli n – alcani ai vari tempi di incubazione (T0, T3 e T6) in Basal
Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v e latte in polvere al 2% p/v in presenza dei morfotipi batterici in consorzio,dove n in Cn indica il numero di carboni del singolo alcano.
Ogni istogramma rappresenta la media ± SEM di 3 esperimenti. Significatività per valori con p<0,005 (T - student).
Figura 14 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v e latte in polvere
69
Si osserva un effetto di inibizione da co - metabolita rispetto ad una incubazione del consorzio in assenza di latte. Tuttavia la capacità del consorzio di ossidare la frazione ad alto peso molecolare rimane sostanzialmente inalterata.
Analisi della capacità degradativa dei diversi morfotipi in coltura axenica
I singoli morfotipi sono stati analizzati in relazione alla loro capacità di degradare il gasolio in coltura axenica.
In Figura 15 è possibile osservare la rimozione di ogni alcano lineare ai diversi tempi di incubazione, espresso come concentrazione, a carico dei morfotipi Con 1, NM 1, G 1, G 2, M 1, M2.
71 Figura 15 Rimozione dei singoli alcani lineari, presenti nel gasolio, in tre tempi differenti di incubazione (T0, T3 e T6) in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v a carico dei
diversi morfotipi, dove n in Cn indica il numero di atomi di carbonio dell'alcano. Ogni
istogramma rappresenta la media ± SEM di 3 esperimenti. Significatività per valori con p<0,005 (T - student).
72
I risultati in figura 15 sono espressi come il variare della concentrazione di ogni singolo alcano (da C12 a C35) con il tempo di incubazione. I dati ottenuti sono stati espressi anche come percentuale di degradazione del totale degli n-alcani lineari (Tabella 10) e come percentuale di degradazione degli idrocarburi non lineari C>12 (Tabella 11).
Nello specifico è possibile osservare che: Con1
È in grado di degradare il 67,01% degli alcani lineari (Tabella 10);
È in grado di degradare il 10% degli alcani non lineari C>12. (Tabella 11);
La riduzione percentuale di ogni singolo alcano lineare presente nel gasolio è osservabile nella figura 16. Il cromatogramma è visibile in figura 17.
Figura 16 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v di Con1.
73 Figura 17 Cromatogramma del morfotipo CON 1 corrispondente alla degradazione degli alcani dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v.
Si osserva che, mentre il consorzio dei diversi morfotipi degrada quasi completamente ogni singolo alcano dopo 6 giorni di incubazione, Con 1 degrada il 67,01% degli alcani lineari in Basal Salt Medium e di questi degrada quasi totalmente alcani come C27 ma anche alcani con peso molecolare più basso seppur in percentuale minore.
74
Per M1 si osserva che:
È in grado di degradare il 18,20% degli alcani lineari (Tabella 10)
È in grado di degradare il 46% degli alcani non lineari C>12 (Tabella 11).
La riduzione percentuale di ogni singolo alcano lineare presente nel gasolio è osservabile nella figura 18. Il cromatogramma è visibile in figura 19.
Figura 18 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v di M1.
75 Figura 19 Cromatogramma del morfotipo M 1 corrispondente alla degradazione degli alcani
dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v.
Si osserva che M 1 degrada il 18,20% degli alcani lineari in Basal Salt Medium e di questi degrada principalmente alcani come C31 e C32, mostrando una capacità di degradazione più bassa per gli alcani a peso molecolare minore, mentre il consorzio dei diversi morfotipi degrada quasi completamente ogni singolo alcano dopo 6 giorni di incubazione.
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Per M2 si osserva che:
È in grado di degradare il 17,91% degli alcani lineari (Tabella 10)
È in grado di degradare il 15% degli alcani non lineari C>12 (Tabella 11).
La riduzione percentuale di ogni singolo alcano lineare presente nel gasolio è osservabile nella figura 20. Il cromatogramma è visibile in figura 21.
Figura 20 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v di M2.
77 Figura 21 Cromatogramma del morfotipo M 2 corrispondente alla degradazione degli alcani
dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v.
Mentre il consorzio dei diversi morfotipi degrada quasi completamente ogni singolo alcano dopo 6 giorni di incubazione per il morfotipo M 2 si osserva che è in grado di degradare il 17,91% degli alcani lineari in Basal Salt Medium e di questi degrada principalmente alcani come C17 e C21, mostrando una capacità di degradazione più bassa per gli alcani a basso peso molecolare e una totale incapacità di degradare alcani ad alto peso molecolare dal C23 al C33 eccetto che per C26.
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Per NM1 si osserva che:
È in grado di degradare il 29,04% degli alcani lineari (Tabella 10)
È in grado di degradare il 50% degli alcani non lineari C>12 (Tabella 11).
La riduzione percentuale di ogni singolo alcano lineare presente nel gasolio è osservabile nella figura 22. Il cromatogramma è visibile in figura 23.
Figura 22 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v di NM 1.
79 Figura 23 Cromatogramma del morfotipo NM 1 corrispondente alla degradazione degli alcani
dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v.
Per il morfotipo NM1 si osserva che è in grado di degradare il 29,04% degli alcani lineari in Basal Salt Medium e di questi degrada totalmente alcani a lunga catena da C33 a C35 come accade per il consorzio dei diversi morfotipi.
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Per G1 si osserva che:
È in grado di degradare il 26,60% degli alcani lineari (Tabella 10).
È in grado di degradare il 40% degli alcani non lineari C>12 (Tabella 11).
La riduzione percentuale di ogni singolo alcano lineare presente nel gasolio è osservabile nella figura 24. Il cromatogramma è visibile in figura 25.
Figura 24 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v di G 1.
81 Figura 25 Cromatogramma del morfotipo G 1 corrispondente alla degradazione degli alcani
dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v.
Il morfotipo G1 degrada il 26,60% degli alcani lineari in Basal Salt Medium e di questi degrada quasi totalmente alcani a basso peso molecolare come C12. Il morfotipo G1 sembra però totalmente incapace di degradare alcani con numero di atomi di carbonio compresi tra C26 e C35, al contrario completamente rimossi dal consorzio dei diversi morfotipi al T6 della sperimentazione.
82
Per G2 si osserva che:
È in grado di degradare il 78,35% degli alcani lineari (Tabella 10).
È in grado di degradare il 33% degli alcani non lineari C>12 (Tabella 11).
La riduzione percentuale di ogni singolo alcano lineare presente nel gasolio è osservabile nella figura 26. Il cromatogramma è visibile in figura 27.
Figura 26 Percentuali di rimozione dei singoli alcani lineari presenti nel gasolio dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v di G 2.
83 Figura 27 Cromatogramma del morfotipo G 2 corrispondente alla degradazione degli alcani
dopo sei giorni di incubazione in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v.
Il morfotipo G2 degrada il 78,35% degli alcani lineari in Basal Salt Medium mostrando la capacità di degradare quasi totalmente alcani lineari con atomi di carbonio compresi tra C12 e C28. Il morfotipo G2 mostra però una bassa capacità di degradazione dell’ alcano C29 e una totale incapacità di degradare alcani ad alto peso molecolare con numero di atomi di carbonio compresi tra C30 e C35.
84
Dall'analisi dei cromatogrammi (Figure 17, 19, 21, 23, 25, 27) si nota un picco con tempo di ritenzione intorno ai 20 minuti (Figura 28) che la banca dati NIST Mass Spectra Database 2013 ha identificato come C18 metilestere. Il morfotipo Con 2 mostra una capacità di abbattere il C18 metilestere già al T3 della sperimentazione pari al 98% (Tabella 12). Dal cromatogramma in figura 28 è infatti possibile osservare la riduzione del picco corrispondente al C18 metilestere già dal primo tempo della sperimentazione T3.
Figura 28 Cromatogramma del morfotipo Con 2. Le frecce in verde indicano il picco corrispondente al C18 metilestere.
85
E’ stata quindi valutata la riduzione percentuale del picco corrispondente al C18 metilestere per gli altri morfotipi utilizzati nel corso delle sperimentazione (Tabella 12).
Ceppo % riduzione T3 % riduzione T6
Con 1 Con 2 M1 M2 NM1 G1 G2
Consorzio in Basal Salt Medium addizionato di
gasolio all’1% v/v Consorzio in Basal Salt Medium addizionato di gasolio all’1% v/v e latte al
2% p/v 0% 98% 54% 0% 44% 0% 0% 100% 100% 5% 98% 70% 0% 76% 40% 33% 100% 100%
Tabella 12 Tabella riassuntiva delle percentuali di riduzione del C18 metilestere ad opera dei morfotipi in coltura axenica e del consorzio in Basal Salt Medium addizionato di gasolio
86 Analisi microbiologica culture – independent
Identificazione dei morfotipi
L’attribuzione a generi eventualmente diversi dei morfotipi è stata effettuata mediante analisi ARDRA dell’amplificato per PCR del gene 16S rDNA (Figura 29).
Figura 29 Elettroforesi su gel d’agarosio 2% dei campioni amplificati mediante PCR. Lane 1: marcatore molecolare 1Kb SharpMass TM DNA Ladder EuroClone, Lane 2-10: prodotto di amplificazione del gene 16 S rDNA dei 9 campioni, Lane 11: controllo positivo con E. Coli,
Lane 12: controllo negativo.
Più nel dettaglio
L’analisi molecolare dei morfotipi è stata perseguita per mezzo dell’estrazione del DNA genomico da coltura pura per ciascuno di nove candidati , seguita da una reazione di PCR per amplificare il gene che codifica per l’RNA ribosomale 16 S, utilizzando i primer universali 27F e 1492R (Tabella 6). Il prodotto di amplificazione è stato sottoposto ad un ARDRA, con le endonucleasi di restrizione Sau 3, Alu I e Hae 3 (Tabella 5). Sono stati individuati due diversi pattern di restrizione generati dagli enzimi di restrizione per i prodotti di amplificazione, riconducibili a due distinte Operational Taxonomic Unit OTU, come mostrato in figura 30.
Lan e 1 Lan e 2 Lan e 3 Lan e 4 Lan e 5 Lan e 6 Lan e 7 Lan e 8 Lan e 9 Con troll o + Con troll o -
87 Figura 30 ARDRA dei nove morfotipi dal con enzimi Sau III (primo riquadro a sinistra), Alu I
(riquadro centrale) e Hae III (ultimo riquadro a destra) in gel di agarosio al 2%.
Un ceppo per ogni OTU è stato inviato a sequenziare per un totale di 500 bp al 5’ del gene che codifica per il 16S rDNA e la sequenza ottenuta è stata confrontata in banca dati Ribosomal Database Project (Maidak et al., 1996) per associare alla sequenza ottenuta il genere batterico di riferimento confrontando le sequenze ottenute con quelle già depositate. I risultati sono illustrati in Tabella 13.
Ceppo Omologia Genere Accession N°
Con 1, G 2, Con 3, M 1 Con 2, NM1, NM 2, M 2, G 1 100% 100% Stenotrophomonas sp. Pseudomonas clororaphis JQ917828 HF585008
Tabella 13 Distribuzione dei morfotipi nelle due OTU ottenute ed indicazione del genere batterico di appartenenza.
Le analisi molecolari hanno inoltre previsto l’amplificazione per PCR del DNA genomico dei nove morfotipi con primer specifici in grado di amplificare il gene alkB che codifica per una idrossilasi capace di degradare alcani a diverso peso molecolare. I primer utilizzati sono presenti in tabella 7. Delle quattro coppie di primer utilizzate, solo i primer Alk-H1 Forward e Alk-H3 Reverse hanno mostrato prodotto di amplificazione
88
del gene alkB delle dimensioni attese (van Beilen & S.B., 2005). Il prodotto di amplificazione ottenuto è stato eluito da gel e sequenziato indicando la corretta amplificazione del corrispondente gene alkB (figura 31).
Figura 31 Elettroforesi su gel d’agarosio 2% dei morfotipi amplificati mediante PCR con primer AlkH1F/AlkH3R.
Analisi della diversità microbica mediante DGGE
L’analisi dell’ecologia microbica del sedimento è stata eseguita scegliendo la tecnica DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Figura 32). L’analisi ha previsto l’estrazione del DNA dal sedimento e l’amplificazione per PCR con i primer P2 e P3 (Tabella 7), specifici per l'amplificazione della regione V3 del gene 16S rDNA (Muyzer et
al., 1993); Il gene che codifica per l’RNA ribosomale 16 S è dotato di regioni
ipervariabili quali V3 di circa 150 bp, caratterizzate da sequenze nucleotidiche specie - specifica, per cui l’analisi permette di discriminare microrganismi appartenenti a specie diverse.Sono stati scelti due campioni di DNA delle comunità microbiche estratte dal sedimento: un campione proveniente dal sedimento prima del trattamento chimico – fisico effettuato da Teseco S.p.a. per rimuovere cloruri e metalli e un campione di sedimento dopo il trattamento chimico - fisico.
C o n 1 C o n 2 C o n 3 N M 1 N M 2 M 1 G 1 M 2 G 2
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Figura 32 : Elettroforesi su gel di poliacrilammide in gradiente denaturante 40 - 60% della regione V3 del gene 16 S rDNA dei campioni metagenomici estratti dal sedimento prima e dopo il trattamento chimico –fisico (Lane 1 e 2). Con 1 (Lane 3), Con 2 (Lane 4), Con 3 (Lane
5), M 1 (Lane 6), M 2 (Lane 7), NM 1 (Lane 8), NM 2 (Lane 9), G 1 (Lane 10), G 2 (Lane 11).
Il risultato dell’analisi DGGE mostra una comunità microbica eterogenea, sostanzialmente priva della presenza di popolazioni dominanti come frequenza numerica, ad eccezione di due bande presenti entrambi nei due campioni di sedimento, che sono a tutt’oggi in elaborazione. Nella parte destra del gel è possibile osservare la regione ipervariabile V3 corrispondente ai diversi morfotipi. Il pattern di migrazione nel gel dei 9 morfotipi evidenzia che gli isolati non corrispondono a generi dominanti in termini numerici nell’ecologia batterica dei sedimenti prima e dopo il trattamento chimico - fisico. Le bande corrispondenti ai morfotipi sono in sequenziamento tuttavia è ragionevole pensare che i due generi batterici individuati corrispondano ad una singola specie batterica ciascuno, ovvero una per il genere
Pseudomonas (Lane 4, 7, 8, 9 e 10) ed una specie per il genere Stenotrophomonas (Lane 3, 5, 6 e 11). Analisi ceppo specifiche sono in corso. D’altre parte è evidente che il trattamento chimico - fisico non altera significatamente l’ecologia microbica del sedimento nei limiti delle tecniche utilizzate per l’analisi di interesse.
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