3.1 Reagenti
La γ-Glutammil-7-amido-4-metilcumarina (γGluAMC, G7261), la Glicilglicina (GlyGly, G1002) e tutti i reagenti chimici sono stati acquistati dalla Sigma- Aldrich (Italia).
3.2 Soggetti partecipanti allo studio
Nello studio sono compresi complessivamente 65 pazienti, di cui 34 maschi e 31 femmine, tutti affetti da patologie ematologiche che sono stati sottoposti a trapian- to di cellule staminali allogenico od autologo presso la U.O. Ematologia universi- taria di Pisa, in un periodo di tempo compreso tra il 2008 e il 2013.
Il primo gruppo di pazienti arruolati nello studio è costituito da 23 pazienti (11 maschi e 12 femmine) sottoposti a trapianto allogenico che hanno sviluppato
GVHD in seguito alla procedura trapiantologica.
Per quanto riguarda le patologie di cui i pazienti risultavano affetti: 15 pazienti af- fetti da patologie mieloidi (13 leucemia mieloblastica acuta, 3 sindromi mielodi- splastiche, 1 leucemia mieloblastica cronica) e 8 pazienti affetti da patologie lin- foidi (4 linfoma non Hodgkin, 3 leucemia linfoblastica acuta, 1 leucemia linfobla- stica cronica). Di questi, 16 pazienti sono stati sottoposti a un regime di condizio- namento mieloablativo, e 7 ad un regime di condizionamento a ridotta intensità. Il secondo gruppo di pazienti è costituito da individui che in seguito a trapianto
allogenico non hanno sviluppato GVHD, ed è composto da: 28 soggetti totali, di
cui 19 maschi e 9 femmine, sottoposti a trapianto di cellule staminali emopoieti- che a causa di varie patologie ematologiche, tra cui 17 patologie mieloidi (6 sog- getti affetti da sindrome mielodisplastica, 7 da leucemia mieloblastica acuta, 2 da leucemia mieloide cronica, 1 da leucemia mielomonocitica cronica e 1 da sarcoma granulocitario) e 11 patologie linfoidi (3 soggetti affetti da linfoma non Hodgkin,
54 3 da mieloma multiplo, 4 da leucemia linfoblastica acuta, 1 da leucemia linfocitica cronica). Di questi, 23 pazienti sono stati sottoposti ad un regime di condiziona- mento mieloablativo, e 5 ad un regime di condizionamento a ridotta intensità Il terzo gruppo in esame, infine, risulta costituito dai pazienti sottoposti a trapian-
to autologo; in questo tipo di trapianto la GVHD non rappresenta una possibile
complicanza, e per questo abbiamo considerato tali pazienti come gruppo di con- trollo. Il gruppo è costituito da 14 pazienti (4 maschi e 10 femmine), tutti affetti da patologie linfoidi (7 da linfoma non Hodgkin, 5 da mieloma multiplo, 1 da lin- foma di Hodgkin, 1 da leucemia linfatica cronica).
Per ciascun paziente abbiamo analizzato campioni di sangue periferico ottenuti mediante prelievo venoso in provetta contenente EDTA, e tali prelievi sono stati eseguiti a tempi prestabiliti secondo il seguente schema:
Prelievo Giorno
1 Prima dell’inizio della chemioterapia
2 Giorno 0 (giorno del trapianto)
3 Giorno +7
4 Giorno +14
5 Giorno +30
6 Giorno +60
7 Giorno +90
X Ogni volta che si realizzi un successivo incremento di GGT du-
rante gli esami eseguiti per il normale follow-up del paziente Lo studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Bioetica e tutti i soggetti hanno dato il loro consenso informato ad essere inclusi nello studio stesso.
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3.3 Determinazione delle frazioni plasmatiche di GGT
Il prelievo di sangue per l’analisi della GGT è stato eseguito in provette sottovuo- to contenenti EDTA come anticoagulante ed antiossidante. Il plasma è stato otte- nuto centrifugando il campione a 1500 giri per 15 minuti a temperatura ambiente ed è stato conservato a -20°C.
La determinazione dell’attività totale della GGT e delle sue frazioni è stata esegui- ta con un sistema FPLC (“fast liquid protein crhomatography”) utilizzando una colonna per cromatografia ad esclusione molecolare che consente di separare le componenti plasmatiche in base al loro peso molecolare. Le frazioni di GGT sono state separate attraverso un’eluizione isocratica, al flusso di 0,5 ml/min, con un tampone sodio fosfato 0,1 mol/L (pH 7,4) contenente NaCl 0,2 mol/L, EDTA 0,1 mmol/L e GlyGly 5,4 mmol/L. Per poter determinare in continuo l’attività di GGT a valle della colonna, attraverso una connessione a T, all’eluato della gel filtrazio- ne è stata continuamente aggiunta una soluzione contenente il substrato fluore- scente per la GGT, γ-Glutammil-7-amido-4-metilcumarina (γGluAMC), rilasciata al flusso di 0,1 mL/min. La miscelazione dell’eluato dalla colonna con il substrato della GGT avviene in una spira con volume di 2,6 ml (corrispondente ad un’incubazione di circa 4 minuti) posta in un bagnetto termostatico a 37°C.
Poiché l’accettore della reazione catalizzata dalla GGT è incluso nella fase mobi- le, la presenza dell’enzima è visualizzata attraverso la liberazione del composto fluorescente ammino-metil-cumarina (AMC) secondo la reazione:
γ-Glu-AMC + GlyGly→ γ-Glu-GlyGly + AMC
Il prodotto AMC è rilevato tramite un fluorimetro operante a una lunghezza d’onda di eccitazione di 380 nm e di emissione di 440 nm. La soluzione madre di γGluAMC è stata preparata alla concentrazione di 4,5 mmol/L in etanolo 30% w/w contenente NaOH 0,005N e conservata a una temperatura di -20° C. Questa soluzione è stata diluita giornalmente 25 volte in tampone Tris-HCl 0,25 M, pH 8,5 (25°C).
56 L’intensità di fluorescenza del segnale è espresso in unità arbitrarie di fluorescen- za (f.u.) e l’area sotto i picchi è proporzionale all’attività di GGT.
Figura 3.1: Schema delle componenti dello strumento per la separazione e la determina-
zione dell’attività totale di GGT e delle sue frazioni.
Pompa FPLC
0.5 mL/min
E
sc
lu
sio
ne
Mo
lec
ol
ar
e
V
inj= 100 µL, plasma diluito 1:4
Spira di reazione
(37 C)
Spettrofluorimetro
λ
ex= 380 nm, λ
em= 440 nm
Pompa post-iniezione
0.1 mL/min
γ-Glutammil-7-Amido-
4-MetilCumarina
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3.4 Quantificazione delle frazioni di GGT
L’attività totale di GGT, espressa in U/L, è stata calcolata in base ad una curva di calibrazione ottenuta dal grafico nel quale è stata riportata l’area totale (f.u. x ml) sottesa al cromatogramma dell’attività di GGT dei soggetti in funzione dell’attività totale del plasma iniettato (fattore di sensibilità ± SD = 4.62 ± 0.06 area x L x U-1; intercetta ± SD = 16.4 ± 1.6 area; r2 = 0.96, P< 0.0001).
L’area delle frazioni di GGT è stata calcolata con l’aiuto del software MATLAB (Version 7 MathWorks, Inc.). Il programma permette di descrivere ogni picco con una curva Gaussiana modificata esponenzialmente, per ogni curva sono stati defi- niti gli intervalli di variazione dell’altezza, della larghezza a metà altezza, della posizione e della asimmetria. L’area è stata calcolata utilizzando un algoritmo non lineare di minimizzazione dei minimi quadrati, la somma delle quattro curve così ottenute corrisponde al cromatogramma registrato.
3.5 Statistica
Per il confronto statistico fra i valori delle frazioni di GGT dei soggetti che hanno sviluppato un tipo di GVHD rispetto a quelli che non la hanno sviluppata è stato utilizzato il test t non parametrico. Il confronto statistico tra i valori delle frazioni di GGT dei soggetti sottoposti a trapianto di cellule staminali emopoietiche ai vari tempi precedenti e successivi il trapianto è stata eseguita con il test t non parame- trico per dati appaiati (test di Wilcoxon). Una correlazione con un P <0.05 è stata considerata significativa.
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