Meccanismi molecolari della plasticità peririnale

La memoria di riconoscimento come altre forme di memoria può riguardare i quindici minuti successivi alla visione di un oggetto così come può andare anche oltre le ventiquattro ore. Un dogma che si è ormai consolidato nella moderna neurobiologia, descrive meccanismi molecolari diversi per memorie di durata diversa, e in particolare, prevede che le memorie a lungo termine sfruttino la sintesi proteica. Il fattore di trascrizione più noto nel campo della plasticità sinaptica è CREB. CREB è una proteina che si lega a specifici segmenti di DNA, chiamati elementi di risposta al cAMP (CRE) e regola l’espressione dei geni

vicini. Ci sono due forme di CREB: CREB-2 reprime l’espressione genica; CREB-1 attiva la trascrizione, ma solo quando è attivata da una chinasi. La corteccia peririnale non intacca il dogma: quando un animale deve ricordare un oggetto visto il giorno prima c’è bisogno che CREB-1 in peririnale sia fosforilato (fig. 20, Warburton et al 2005).

Figura 20 Attivazione di cFos e pCREB in corteccia peririnale. Il ratto è stato

sacrificato dopo la prima presentazione ad uno stimolo nuovo. cFOS e pCREB sono evidenziati mediante espressione di EGFP introdotta per inoculazione di adenovirus. Le linee bianche in (a), (b) e (c) indicano i confini fra corteccia temporale (Te2), corteccia peririnale (PRH) e corteccia entorinale (ENT). In (d) la fettina è stata colorata col metodo di Nissl per dimostrare che l’inoculazione non ha provocato danni al solco rinale (rs) e all’ippocampo (HPC). (e) I puntini scuri sono i nuclei che esprimono cFOS. (f) I puntini scuri indicano i nuclei che contengono pCREB.

Prima di arrivare alla sintesi proteica esiste uno straordinario groviglio di strade biochimiche che hanno inizio con l’interazione fra neurotrasmettitori e recettori durante la trasmissione sinaptica e giungono al nucleo attraverso complesse cascate intracellulari. Nel resto di questo paragrafo proverò a descrivere per grandi linee questi circuiti nella corteccia peririnale.

La maggiorparte delle trasmissioni sinaptiche nel sistema nervoso centrale avvengono attraverso il rilascio di glutammato che può agire su tipi diversi di recettori. I recettori glutammatergici possono essere ionotropi (AMPA, NMDA e kainato) oppure metabotropi (mGlu).

Di solito i fenomeni plastici avvengono mediante l’uso di recettori NMDA (Bliss e Collingridge 1993; Bear e Abraham 1996; Kemp e Bashir 2001) ed anche nella peririnale la loro attivazione porta a LTP o a LTD secondo il pattern di stimolazione (Bilkey 1996, Ziakopoulos et al 1999). I recettori NMDA sono eteromeri composti essenzialmente da due subunità NR1 e due o tre subunità NR2. Esistono quattro tipi di subunità NR2 (A-D), ma quelle predominanti nel prosencenfalo sono NR2A, a cinetica più rapida, e NR2B, a cinetica più lenta. Nel cervello adulto, i NR2A si trovano preferenzialmente nella sinapsi, mentre i NR2B sono extrasinaptici (Stocca e Vicini 1998; Rumbaugh e Vicini 1999). Nella corteccia peririnale del ratto adulto i NR2A sono coinvolti nell’espressione di LTP e depotenziamento, mentre i NR2B lo sono nel LTD (Massey et al 2004). Questo ruolo differenziato potrebbe essere dovuto alle diverse cinetiche delle due subunità che comporterebbero differenti livelli di concentrazioni citoplasmatiche del calcio: i NR2B forniscono un più lento aumento di calcio rispetto ai NR2A, i

livelli del calcio rimangono quindi bassi all’inizio e di conseguenza si attivano le fosfatasi piuttosto che le chinasi e si ottiene LTD (Malenka e Bear 2004). In questo disegno mancano le tappe intermedie che trasmettono i segnali dai recettori NMDA al LTP e al LTD (fig. 21).

Figura 21 Cascate intracellulari coinvolte nell’attivazione di CREB. Questo schema è

molto semplificato per motivi di chiarezza. Per una rappresentazione più precisa e aggiornata quotidianamente dalla comunità scientifica si veda il sito http://www.

La cascata intracellulare più nota che prende il via dagli NMDA, coinvolge l’attivazione di GTPasi della famiglia Ras che, a loro volta, attivano le MAP chinasi. Una MAPK molto nota è ERK che induce sia l’espressione precoce sia quella tardiva del LTP (Thomas e Huganir 2004), mentre un’altra MAPK, p38 promuove alcune forme di LTD (Bolshakov et al 2000). Le chinasi ERK più abbondanti nel cervello sono ERK1 ed ERK2. Quando il recettore postsinaptico è stimolato abbastanza ERK2 trasloca nel nucleo ed attiva CREB1 dando il via alla sintesi proteica; ERK1 è meno fosforilato rispetto ad ERK2 ed, in effetti, la sua delezione non è letale come quella d’ERK2 perciò s’ipotizza che ERK1 svolga un ruolo regolatorio negativo sull’azione d’ERK2 (Mazzucchelli et al 2002). L’accoppiamento dell’influsso di calcio attraverso gli NMDA e l’appropriata GTPasi è mediato da specifici fattori che scambiano la guanina (GEF). I GEF più studiati ultimamente, nell’ambito della plasticità sinaptica, sono Ras-GRF1 e Ras- GRF2 che sono attivati dal calcio per mezzo di una calmodulina che lega dei motivi IQ presenti sui loro N-terminali. Nel topo adulto Ras-GRF1 e Ras-GRF2 giocano ruoli opposti nell’espressione della plasticità sinaptica. Ras-GRF1 fa da ponte fra la subunità NR2B del recettore NMDA ed ERK, mentre Ras-GRF2 collega la subunità NR2A alla MAP chinasi. Potete allora immaginare come Ras- GRF1 sia principalmente implicato nell’espressione dell’LTD, mentre Ras-GRF2 serve principalmente all’espressione dell’LTP (fig. 22, Li et al. 2006).

Figura 22 Regolazione di LTP ed LTD per mezzo di Ras-GRF in ippocampo. Le proteine Ras-GRF giocano un ruolo importante nella regolazione di LTP ed LTD solo da P20. Il motivo per cui RasGRF2 attivi di più Erk, mentre RasGRF1 attivi più p38 non è ancora stato determinato.

In accordo con queste evidenze, uno studio recentemente svolto presso l’Istituto di Neuroscienze di Pisa dal gruppo di Berardi ha dimostrato che ERK1 è influenza l’espressione dell’LTP e che Ras-Grf1 è necessario per indurre LTD nella corteccia peririnale del topo (fig. 23).

Figura 23 LTD peririnale. L’LTD è stato ottenuto mediante perfusione di carbacolo per

10 minuti. L’LTD colinergico nei topi RasGRF1 KO è significativamente ridotto.

Si ritiene che la via finale che conduce alla depressione a lungo termine di una sinapsi in maniera NMDA-dipendente sia l’internalizzazione dei recettori AMPA (Ashby et al 2004). Ma come viene attivata quest’endocitosi? Sembra che nel processo svolga un ruolo importante l’ippocalcina, un membro della famiglia dei sensori neuronali del calcio dotata di un dominio EF. L’ippocalcina accoppia l’attivazione dei recettori NMDA all’internalizzazione dei recettori AMPA secondo questo schema: l’ingresso di calcio spinge l’ippocalcina a formare un complesso con AP-2 che fa parte del macchinario per l’endocitosi clatrina- dipendente; il complesso si lega alla subunità GluR2 del recettore AMPA spiazzando una proteina chiamata NSF e recruta la clatrina (Palmer et al 2005) Un altro meccanismo che induce LTD nella peririnale è attivato dai recettori kainato o KAR (Park et al 2006). Essi sono una sottofamiglia di recettori ionotropi del glutammato pentamerici e si trovano nel sistema nervoso centrale sia a livello presinaptico sia a livello postsinaptico. A livello presinaptico regolano il rilascio di glutammato e GABA, a livello postsinaptico mediano le risposte sinaptiche lente. L’induzione di LTD mediante KAR richiede un aumento del calcio postsinaptico che non entra attraverso gli NMDA e i canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo T, ma incrementa grazie agli stessi canali KAR e al

0 2 0 4 0 6 0 8 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 R asG R F 1 K n o ck O u t (n = 8) W ild T yp e (n = 13) E rk1 K n o ck O u t (n = 11) P e rc e n ta g e o f b a s e lin e v a lu e T im e (m in )

rilascio dai depositi intracellulari. I KAR sono regolati via PKC dai recettori mGlu5, che come vedremo tra poco sono molto importanti nella plasticità della peririnale. E’ interessante notare che la trasmissione sinaptica via KAR permette la cattura di segnali coincidenti a bassa, ma non ad alta frequenza, mentre la cosa inversa vale per la trasmissione via NMDA/AMPA.

Nella peririnale un ruolo necessario per l’induzione di LTP ed LTD lo svolgono i recettori mGlu. Si tratta di classici recettori accoppiati alla proteina G con sette passi transmembrana; sono classificati in tre classi o gruppi in base al profilo farmacologico, all’omologia di sequenza e alla cascata di segnale. I recettori del gruppo I attivano la via di segnalazione dell’inositolo fosfolipide, mentre quelli del gruppo II e III sono accoppiati negativamente all’adenilato ciclasi (Conn e Pin 1997; De Blasi et al 2001). Gli agonisti del gruppo I (3,5-diidrossifenilglicina) e del gruppo II ((2S,2’R,3’R)-2-(2’,3’-dicarbossilciclopropil)glicina) promuovono l’LTD (McCaffery et al 1999) nella corteccia peririnale. In CA1 e nel giro dentato dell’ippocampo, dove ugualmente questi agonisti inducono LTD, è noto che il sottotipo di recettore mGluI interessato è il 5° (Palmer et al 1997). Nella corteccia peririnale è molto probabile che si tratti dello stesso sottotipo. Il ruolo di questi recettori resta cruciale anche quando s’induce l’LTD elettricamente, un metodo più fisiologico in quanto mima una plasticità sinapsi-specifica e attività- dipendente attraverso l’attivazione dei canali NMDA. mGlu di gruppo I, mGlu di gruppo II ed NMDA sono importanti quando s’induce l’LTD con 200 stimoli a 1 Hz bloccando il potenziale del neurone a -70 mV (Cho et al. 2000). Se il potenziale è tenuto invece a -40 mV i mGlu di gruppo II non sono più necessari. Questa dipendenza dal potenziale è dovuta ad una sinergia che esiste fra i recettori del gruppo I e del gruppo II (Schoepp et al 1996). Questa sinergia consiste nell’aumentare il rilascio di calcio dai depositi intracellulari che normalmente risulta dall’attivazione dei mGlu di gruppo I. Quando il calcio che entra attraverso gli NMDA è poco a causa del potenziale a -70 mV, la sinergia dei due gruppi di metabotropi riesce a soddisfare la necessità di calcio per l’induzione dell’LTD. A - 40 mV i canali NMDA sono tutti aperti e quindi non c’è più bisogno dell’aiuto dei mGlu di gruppo II (fig. 24).

Figura 24 Il ruolo dei recettori glutammatergici nell’induzione dell’LTD. (a) A –70 mV

il flusso di ioni calcio attraverso i canali NMDA è minimizzato dal blocco voltaggio- dipendente del magnesio. I recettori mGlu di gruppo II (mGlu2/3) aumentano la mobilizzazione del calcio grazie all’attivazione dei recettori mGlu di gruppo I (mGlu1/5) per defosforilazione. La combinazione dell’influsso di calcio mediata da NMDA e mGlu induce LTD. Bloccando i mGlu di gruppo II con (S)-alpha- etilglutammato (EGLU) previene la sinergia fra i recettori metabotropi, riduce il calcio in ingresso e previene l’LTD. (b) A –40 mV il flusso di calcio attraverso gli NMDA aumenta perché viene meno il

blocco del magnesio. Anche bloccando mGlu2/3 con EGLU si ottiene LTD perché l’ingresso di calcio resta alto. I cerchietti G rappresentano la proteina G.

In peririnale, il principale mGluR di tipo I è mGluR5 che abbiamo già visto sopra, mentre il principale mGluR di tipo II è mGluR2. L’attivazione di mGluR2 provoca una diminuzione dei livelli di cAMP e quindi una minore attivazione della proteina kinasi A: gli mGluR5 non vengono più fosforilati da PKA e quindi non avviene la loro desensitizzazione, ecco un meccanismo con cui mGluR di tipo I lavorano in sinergia con quelli di tipo II.

L’LTD attività-dipendente che richiede sia i recettori mGlu sia i recettori NMDA è abbastanza insolito perché classicamente l’LTD dipende dall’attivazione o dei metabotropi o degli ionotropi. Se si registra l’attività di un neurone piramidale peririnale in vitro si osservano delle oscillazioni sottosoglia del potenziale di membrana (D’Antuono et al 2001). La relazione con il potenziale di membrana è un altro aspetto curioso e interessante di questo LTD in quanto insinua il sospetto che in vivo oscillazioni fisiologiche come quelle theta o quelle gamma possano modulare significativamente le modificazioni plastiche che occorrono nella corteccia peririnale (Collins et al 2001; Kirk et Mackay 2003). In effetti, i protocolli d’induzione dell’LTD in vitro prevedono stimolazioni elettriche intense per ampiezza con durate che arrivano fino a 15 minuti. Ma in

vivo la diminuzione della scarica di un neurone peririnale di scimmia avviene

anche quando lo stimolo è ripresentato dopo appena un secondo dalla sua prima comparsa.

Uno studio recente ha dimostrato che l’inizio dell’esperienza visiva con l’apertura delle palpebre è accompagnata da una diminuzione del rapporto tra mGluR5 e recettori M1 suggerendo che l’LTD dipendente dai mGluR serva a rifinire la circuiteria sinaptica, mentre l’LTD dipendente dai recettori colinergici servirebbe alla memoria di riconoscimento (Jo et al 2006).

Oggi è noto che oltre al glutammato anche altri neurotrasmettitori sono importanti per la plasticità sinaptica e fra questi un ruolo di primo piano nella corteccia peririnale lo svolge l’acetilcolina. L’applicazione di carbacolo, un agonista colinergico, provoca un LTD che può durare anche per molto tempo dopo il lavaggio del farmaco e che non ha bisogno né di stimolazione elettrica né dell’attivazione dei canali NMDA (Massey et al 2001). Questa induzione può essere bloccata applicando la pirenzepina che è un antagonista selettivo dei recettori muscarinici M1 oppure la scopolamina che è sempre un’antagonista muscarinico.

A livello intracellulare i recettori muscarinici M1 attivano la via d’ERK via Ras- GRF1 senza usare il calcio, ma per mezzo di una PKA (Yang et al 2003).