minuto d’esplorazione la discriminazione fra due oggetti è solitamente più marcata ( Dix e Aggleton 1999; Winters et al 2004 ). Si calcola un indice di discriminazione che consiste nella proporzione del tempo totale d’esplorazione spesa nell’esplorare l’oggetto nuovo ( vale a dire, la differenza fra i tempi d’esplorazione dell’oggetto nuovo e vecchio diviso la somma dei due tempi ) nel primo minuto d’esplorazione. Questa misura tiene conto delle differenze individuali nel tempo totale d’esplorazione.
Elettrofisiologia
Un altro gruppo di topi non è stato sottoposto al test di riconoscimento dopo l’ultima sessione di familiarizzazione. Gli animali sono stati invece decapitati per condurre gli esperimenti d’elettrofisiologia. Gli animali sono stati anestetizzati con isofluorano e ghigliottinati in accordo con i protocolli del Ministero della Salute. Il cervello è stato rapidamente prelevato e immerso in soluzione di taglio simile al liquor contenente 220,6 mM saccarosio, 3,10 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2
mM MgCl2, 1 mM K2HPO4, 10 mM Hepes, 4 mM NaHCO3, 5 mM destrosio, 0,01
mM glicina, 1 mM ascorbato, 0,5 mM myo-inositolo e 2mM piruvato; pH 7,35. La soluzione era continuamente ossigenata e mantenuta a 4°C. I due emisferi sono stati separati con un bisturi mediante un taglio sagittale lungo il corpo calloso e le
8 sessioni di
familiarizzazione
( 5’ X 2 ogni 90’ )
2 ore
A1
B1
B2
C
Test ( 5 min )
porzioni rostrali e caudali d’ogni emisfero sono state rimosse mediante un taglio inclinato di 45° rispetto all’asse rostrocaudale. Ciascuna metà è stata incollata con cianoacrilato alla piastra di taglio del vibratomo ( Leica, Nussloch, Germany ), con la faccia interemisferica adagiata contro un supporto cubico d’agar all’1,5%. Sono state tagliate fettine di 400 µm comprendenti il solco peririnale, l’entorinale e la corteccia temporale. Esse sono state lasciate a riposare in una camerina contenente soluzione di registrazione a temperatura ambiente ( 20 - 25° C ) per almeno un’ora. La soluzione di registrazione ( ACSF ) contiene 132,8 mM NaCl, 3,10 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM K2HPO4, 10 mM Hepes, 4 mM
NaHCO3, 5 mM destrosio, 0,01 mM glicina, 1 mM ascorbato, 0,5 mM myo-
inositolo e 2mM piruvato, pH 7,35. All’uopo, una singola fetta viene immersa nella camera di registrazione ( 35° C; flusso 2 ml/min ).
Un elettrodo di stimolazione concentrico bipolare ( Frederick Haer Co., Bowdoinham, ME ) è appoggiato sullo strato II/III, da 200 a 300 µm sotto la superficie piale al centro del solco rinale. I potenziali di campo sono registrati con una pipetta di vetro ( 1 - 3 MOhm ) riempita con ACSF e piazzata nello strato II/III del versante temporale del solco rinale a 500 µm dall’elettrodo di stimolazione. La stimolazione è ottenuta con impulsi costanti di corrente della durata di 0,2 ms ad una frequenza di 0,033 Hz. Ho usato l’ampiezza dei potenziali di campo evocati nelle vie orizzontali dello strato II/III come misura della risposta sinaptica eccitatoria di popolazione perché in corteccia essa riflette un pozzo di corrente monosinaptica ( Kirkwood et al 1996 ). Dopo almeno 30 minuti di stimolazione con un’intensità che produceva circa il 50% di risposta massimale, ho registrato una curva I/O con stimolazioni da 50 µA a 200 µA con incrementi di 50 µA.
Dopo 20 minuti di registrazione con risposta stabile ad impulsi che provocavano il 50-70% della risposta massimale ( baseline A ), sono stati somministrati un theta burst per l’LTP o una paired pulsed low frequency
stimulation ( PP-LFS ) per l’LTD secondo il tipo d’esperimento. Un theta burst
consiste in una stimolazione con 4 treni, uno ogni 15 secondi, di 10 scariche da 4 impulsi a 100 Hz con un intervallo di 200 ms tra ogni scarica. La PP-LFS consiste in 900 coppie d’impulsi intervallati da 200 ms a 2 Hz e ad intensità doppia rispetto a quella di registrazione. Dopo la prima induzione si torna alla stimolazione di base per 30 minuti ( baseline B ), poi una nuova induzione, altri 30 minuti di registrazione standard ( baseline C ), una terza induzione e 45 minuti finali di registrazione standard ( baseline D ). In alcuni casi d’esperimento di
LTD, l’ultima registrazione è stata seguita da un theta burst ed una nuova registrazione standard per valutare la vitalità delle sinapsi depresse. Per cominciare a studiare il meccanismo molecolare d’induzione dell’LTD con la PP- LFS 7 fette d’altri 3 topi sono state trattate con (±)-3-(2-carboxypiperazin-4-
yl)propyl-1-phosphonato ( CPP ) 20 µM, un potente bloccante dei recettori
NMDA, dieci minuti dopo l’inizio della registrazione della baseline fino a 10 minuti dopo la PP-LFS. I risultati sono stati confrontati con quelli di 7 fette di controllo prese da altri 2 topi. Alla fine d’ogni registrazione, è stato somministrato acido chinurenico 1mM, un potente bloccante glutammatergico, per valutare la componente non post sinaptica dell’onda registrata. Sono state eliminate a posteriori tutte le registrazioni che mostravano un cambiamento d’ampiezza dell’artefatto elettrico o del volley presinaptico e una componente post sinaptica minore del 70% dell’onda registrata.
RISULTATI
L’overtraining determina una buona memoria di riconoscimento a 2 ore
Ho sottoposto 16 topi al protocollo di familiarizzazione distribuita (
overtraining ) con due diversi oggetti nell’Y-maze. I due oggetti sono stati
scambiati di posto prima d’ogni sessione rispetto alla precedente. Nella prima sessione di familiarizzazione i topi esploravano l’oggetto posto nel braccio destro per 14,01 secondi e quello posto nel braccio sinistro per 14,84 secondi. Nell’ottava e ultima sessione di familiarizzazione i topi esploravano l’oggetto posto nel braccio destro per 2,94 secondi e quello posto nel braccio sinistro per 3,14 secondi. Visto che la posizione dei due oggetti rispetto ai due bracci dell’Y-
maze era controbilanciata si può inferire che i topi esploravano alla stessa maniera
i due oggetti senza distorsioni dovute alla posizione ( ANOVA a due vie per misure ripetute, posizione × sessione, P = 0,059 ).
Dopo 2 ore dall’ultima familiarizzazione ho rimesso gli animali nell’Y-maze sostituendo uno dei due vecchi oggetti con un nuovo oggetto. I topi esploravano maggiormente l’oggetto nuovo ( t test per dati appaiati, P ≤ 0,001 ) con un tempo totale d’esplorazione di 16,81 secondi. L’indice di discriminazione era di 0,31 ± 0,06 SEM.
Si noti come i tempi d’esplorazione nell’ultima sessione d’esplorazione sono inferiori rispetto a quelli della prima sessione, tuttavia gli animali mostrano un parziale recupero della curiosità quando è aggiunto il nuovo oggetto.
La paired pulses low frequency stimulation induce un LTD NMDA- dipendente
Ho valutato la capacità di indurre un LTD delle connessioni orizzontali nello strato II/III della corteccia peririnale mediante paired pulsed low frequency
stimulation ( PPLFS ) e dopo ne ho studiato la dipendenza dai recettori NMDA.
La PPLFS delle connessioni orizzontali nello strato II/III della corteccia peririnale è in grado di provocare un LTD del 28,16% ± 0,53 SEM a 45 minuti dall’induzione. La depressione della via sinaptica è inibita dal CPP, un antagonista dei recettori NMDA, visto che in questo caso l’LTD e del 6,28% ± 0,92 SEM ( ANOVA a due vie per misure ripetute, trattamento × tempo, P ≤ 0,001; nessun’interazione, P = 0,093 ).
L’apprendimento visivo induce un indebolimento della forza delle connessioni peririnali orizzontali
Ho sottoposto un gruppo di 12 topi ad overtraining senza oggetti visivi ( controlli ) ed un gruppo di 12 topi ad overtraining con oggetti visivi ( trattati ). Dopo 2 ore dall’ultima sessione d’overtraining ho registrato ex vivo i potenziali di campo attraverso le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale in fettina. L’analisi delle due curve input / output mediante ANOVA a due vie per misure ripetute ( intensità di stimolazione × trattamento ) mostra un’interazione significativa fra i due fattori ( P = 0,02 ) confermata dall’analisi delle aree sotto le curve (AUC; ANOVA a una via, P = 0,028) . E’ evidente che la familiarizzazione visiva provoca una diminuzione dell’output sinaptico lungo le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale.
La memoria di riconoscimento visivo è sostenuta da cambiamenti complementari di LTD ed LTP peririnali
Ho tentato di capire se questa diminuzione di guadagno è dovuta ad un meccanismo simile a LTD sottoponendo un gruppo di 8 topi ad overtraining senza oggetti visivi ( controlli ) ed un gruppo di 8 topi ad overtraining con oggetti visivi ( trattati ) e registrato ex vivo i potenziali di campo attraverso le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale in fettina a 2 ore dall’ultima sessione d’overtraining e dopo tre induzioni di LTD mediante PPLFS. Il gruppo di controllo presentava una LTD del 47,07% ± 0,37 SEM, mentre il gruppo d’animali trattati mostrava un LTD del 30,47% ± 0,45 SEM. Se ne deduce che gli animali che hanno familiarizzato con gli oggetti mostrano un’occlusione parziale dell’LTD ( ANOVA a due vie per misure ripetute, tempo × trattamento, P = 0,043; non c’è interazione tra i due fattori, P = 0,401 ). Successivi test post hoc di Student-Newman-Keuls dimostrano che l’LTD dopo la seconda induzione non è saturato né nel gruppo di controllo ( P = 0,003 ), né nel gruppo d’animali trattati ( P = 0,039 ). L’esame della figura mostra in ogni modo una tendenza maggiore alla saturazione dell’LTD negli animali trattati. Ho verificato se le sinapsi apparentemente depresse conservassero la capacità di andare incontro ad LTP somministrando un theta burst. Entrambi i gruppi mostravano un ripotenziamento delle sinapsi in precedenza depresse ( dati rinormalizzati, controlli: 11,73% ± 0,73 SEM, trattati: 16,58% ± 0,72 SEM ).
Se l’LTD ipotizzato durante la familiarizzazione visiva muove l’efficacia sinaptica verso valori più bassi entro un range di modificazione sinaptica inalterato, è possibile prevedere una maggiore capacità di andare incontro ad LTP nella corteccia peririnale degli animali che hanno effettivamente incontrato degli oggetti visivi durante l’overtraining rispetto a quelli che non ne hanno visti. Ho allora sottoposto un gruppo di 7 topi ad overtraining senza oggetti visivi ( controlli ) ed un gruppo di 7 topi ad overtraining con oggetti visivi ( trattati ) e registrando ex vivo i potenziali di campo attraverso le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale in fettina a 2 ore dall’ultima sessione d’overtraining e dopo tre induzioni di LTP mediante theta burst.La precedente previsione era giusta visto che il gruppo di controllo presentava un LTP del 5,20%
± 6,37 SEM, mentre il gruppo d’animali trattati mostrava un LTP del 33,57% ± 6,98 SEM ( ANOVA a due vie per misure ripetute, tempo × trattamento, P = 0,015; non c’è interazione tra i due fattori, P = 0,425 ).
DISCUSSIONE
Questi risultati dimostrano che la familiarizzazione visiva con un oggetto, utile al suo successivo riconoscimento, è accompagnata da una diminuzione dell’efficacia delle connessioni orizzontali nella corteccia peririnale dovuta ad una depressione a lungo termine delle sinapsi. Sebbene esistano molte evidenze che la familiarizzazione visiva comporti un’attivazione della corteccia peririnale e che le sue connessioni possano andare incontro ad LTD ed LTP, questa è la prima dimostrazione diretta di un cambiamento funzionale delle connessioni corticali associato alla memorizzazione visiva di un oggetto. I miei risultati sono in linea con quelli che hanno dimostrato un’occlusione della plasticità sinaptica mediante apprendimento nella corteccia M1, nell’ippocampo, nella corteccia piriforme, nell’amigdala e nel cervelletto. E’ tuttavia la prima volta che si descrive un processo d’apprendimento che si accompagna ad una diminuzione dell’efficacia sinaptica e ad LTD. D’altra parte, i miei risultati possono essere usati a sostegno dell’ipotesi che la caratteristica riduzione di risposta dei neuroni peririnali alla presentazione di stimoli già noti sia provocata da LTD (Bogacz e Brown 2003; Massey e Bashir 2007).
Si tenga presente che questi risultati si riferiscono alle connessioni orizzontali interne alla peririnale. La depressione delle sinapsi formate dalle collaterali degli assoni corticali potrebbe essere presente in altre aree corticali. Per esempio, in corteccia visiva e in barrel cortex, la riorganizzazione dei campi recettivi in seguito a lesioni o altre perturbazioni sembra essere mediata da connessioni orizzontali (Giannikopuols ed Eysel 2006; Maravall et al 2004).
I miei dati non possono distinguere tra i cambiamenti che risultano da una singola esposizione al nuovo oggetto e quelli che avvengono con le successive presentazioni e dunque non possono descrivere le modificazioni plastiche dovute all’acquisizione di una memoria e quelle dovute al suo consolidamento. Non è quindi possibile escludere che durante l’acquisizione occorrano meccanismi di LTP come ipotizzato in Barker et al 2006. Serviranno nuovi esperimenti senza
overtraining e con diversi intervalli temporali per stabilire cosa succede ai
potenziali di campo per poter trarre delle conclusioni definitive sul ruolo dei cambiamenti osservati nella memoria di riconoscimento.
La registrazione di potenziali di campo non è in grado di rivelare fenomeni di LTP molto specifici e circoscritti. I neuroni peririnali coinvolti nel riconoscimento visivo sono almeno di tre tipi: novelty neurons, familiarity neurons e recency
neurons. E’ possibile prevedere un intervento diversificato di LTD ed LTP sui tre
tipi di neuroni tanto più se si considera che grazie al fenomeno della redistribuzione delle efficacie sinaptiche descritto da Markram e Tsodyks (1996) l’LTP può accompagnarsi ad un innalzamento della risposta al primo impulso, ma ad una riduzione della risposta agli impulsi successivi della scarica presinaptica fisiologica. Questo cambiamento dinamico a breve termine avviene nel corso di 150 ms, un tempo che ben si accorda con quelli registrati mediante ERP durante il riconoscimento visivo di uno stimolo complesso (Thorpe et al 1996). La redistribuzione delle efficacie sinaptiche è sinapsi-specifica quindi è possibile ipotizzare che in una rete neurale con collaterali eccitatorie ricorrenti come quella della corteccia cerebrale, il feedback positivo tenda ad amplificare gli inputs transienti, ma siccome non tutti saranno amplificati equalmente, solo quelli che
coincidono con i patterns memorizzati saranno filtrati e le loro associazioni saranno passate alle stazioni successive. L’ipotesi della presenza di un meccanismo dinamico a breve termine indotto da LTP può essere messa alla prova sia in vivo sia in vitro. Utilizzando il patch-clamp in vivo mirato si potrebbero isolare i vari tipi di neuroni peririnali e registrare i potenziali eccitatori postsinaptici in seguito alla prima e alla seconda presentazione dello stimolo visivo. In vitro, si potrebbero isolare i tre tipi di neuroni del riconoscimento in base alle velocità di sviluppo della plasticità, e studiare le risposte di campo a treni di una decina d’impulsi con una frequenza maggiore di 20 Hz prima e dopo l’apprendimento.
La redistribuzione delle efficacie sinaptiche dovrebbe essere un meccanismo d’origine presinaptica in quanto è molto probabilmente dovuta ad una deplezione più rapida delle vescicole sinaptiche. Sulla base degli esperimenti finora condotti non posso stabilire se i cambiamenti funzionali osservati sono imputabili a meccanismi presinaptici o postsinaptici. La parziale occlusione del LTD NMDA- dipendente mi spinge ad ipotizzare che il fenomeno sia d’origine postsinaptica come descritto in ippocampo da Sacchetti et al (2001; 2002) per il contextual fear
conditioning. La mia ipotesi sarebbe verificata se le curve di paired pulses facilitation registrate nel gruppo di controllo e in quello overtrained risultassero
uguali.
Il marcato effetto dell’apprendimento sulla depressione delle connessioni orizzontali della corteccia peririnale sembra difficile da concettualizzare nel contesto del dettagliato pattern d’informazioni acquisite con la visione di un oggetto.
C’è però da considerare che presentazioni successive di uno stimolo possono indurre nuovi cambiamenti sinaptici più fini come avviene in corteccia motoria man mano che l’addestramento si prolunga (Karni et al 1995). Sarebbe scorretto pensare sulla base dei miei risultati che la capacità informativa della corteccia peririnale sia limitata. I topi utilizzati in questo lavoro sono relativamente naive rispetto agli stimoli insoliti e complessi con i quali sono stati familiarizzati. E’ stato dimostrato che l’apprendimento spaziale non è modificato finché più del 90% delle connessioni ippocampali non siano state saturate ( Moser et al 1998 ). Desimone ha mostrato come l’area di rappresentazione della familiarità di un dato stimolo nella corteccia temporale antero-inferiore si riduce sempre di più man mano che si aggiungono nuove presentazioni dell’oggetto (Li et al 1993). Se la stessa cosa fosse vera per la corteccia peririnale, minime depressioni a lungo
termine residue sarebbero ancora in grado di assicurare nuovi apprendimenti. E’ anche possibile ipotizzare che l’esteso LTD da me osservato non riguardi direttamente i neuroni che rispondono allo stimolo visivo familiare, ma i neuroni intorno per diminuire le interferenze nella rappresentazione. La ripetuta esposizione ad uno stimolo visivo potrebbe condurre ad un rifinimento della sua rappresentazione corticale che comporterebbe una fuoriuscita di molti neuroni dal
pool responsivo, ma una codifica più selettiva, robusta, “contrastata” e dunque
efficiente. In questo senso il fenomeno di familiarizzazione sarebbe molto simile ad un processo di priming (Schacter e Buckner 1998). Se ciò fosse vero si avrebbe finalmente un modello animale in cui studiare le basi molecolari del priming.
(a)
(b)
Desimone (in Erikson et al 2000) ha dimostrato che nella corteccia peririnale delle scimmie si formano con l’esperienza clusters funzionali di neuroni che rappresentano categorie d’oggetti; nello stesso lavoro è stato dimostrato che il fenomeno descritto non è dovuto ad un rafforzamento degli inputs condivisi ai neuroni peririnali. Secondo il modello che vi sto proponendo, la clusterizzazione potrebbe spiegarsi mediante una depressione delle connessioni fra i gruppi neuronali.
Per controllare la mia ipotesi si potrebbero condurre due tipi d’esperimento: misurare mediante tetrodi cronici nell’animale sveglio il grado di decorrelazione fra l’attività di neuroni dislocati in punti diversi alla prima presentazione di uno stimolo visivo e dopo; misurare l’ampiezza dei potenziali di campo in una fettina di peririnale da due elettrodi di registrazione messi in linea con l’elettrodo di stimolazione ed osservare se l’induzione di LTP nel punto più vicino all’elettrodo
1° familiarizzazione
2° familiarizzazione
di stimolazione si accompagni ad una diminuzione d’ampiezza dei potenziali di campo evocati nel punto più distante.
Winters e Bussey hanno recentemente dimostrato che l’infusione di scopolamina in peririnale dopo l’acquisizione della memoria di un oggetto migliora la successiva prestazione di riconoscimento di quell’oggetto nel ratto (Winters et al 2006). E’ stato ipotizzato che il blocco colinergico impedisca l’interferenza con la traccia acquisita da parte di nuovi stimoli incontrati dopo l’acquisizione. Sarebbe interessante utilizzare il protocollo dei miei esperimenti per descrivere i cambiamenti della forza delle connessioni orizzontali in animali trattati con l’antagonista colinergico e negli animali non trattati; inoltre; sarebbe utile sviluppare un modello in vitro dell’interferenza fra tracce mnemoniche nella corteccia peririnale. A questo scopo si potrebbero ad esempio misurare le risposte registrate da un elettrodo piantato sotto il solco rinale (A) in seguito alla stimolazione alternata con un elettrodo sul versante temporale (X) ed uno sul versante entorinale (Y); un LTD indotto sulle connessioni X-A con PPLFS da X non dovrebbe deprimere la via Y-A (Bogacz e Brown 2002), dopo 30 minuti da quest’induzione produciamo una PPLFS da Y: sarebbe sorprendente trovare un blocco del consolidamento del LTD sulla via X-A e ancor di più se questo blocco fosse prevenuto dall’infusione di scopolamina durante la seconda PPLFS.
L’indebolimento delle connessioni orizzontali peririnali è provocato molto probabilmente da fenomeni simili al LTD, ma è possibile pensare anche a cause diverse come una riduzione generalizzata dell’eccitabilità, una diminuzione delle sinapsi attive o l’effetto dello stress. La riduzione dell’eccitabilità delle fibre nervose è stata descritta nelle prime fasi del condizionamento classico nell’ippocampo (Moyer et al 1996) e in M1 (Donoghue 1995). I miei dati sono in contraddizione con questa fenomeno visto che le intensità di stimolazione assolute non sono modificate dalla familiarizzazione visiva ( Mann-Withney Rank Sum test, P = 0,877 ).
Inoltre, una minore eccitabilità dovrebbe ridurre la capacità delle sinapsi di andare incontro a LTP, ma i miei dati indicano un aumento dell’inducibilità del LTP negli animali che hanno appreso. Anche una diminuzione delle sinapsi attive come quella osservata in corteccia visiva e somatosensoriale (Darian-Smith e
Gilbert 1994) mi sembra implausibile, giacché nella maggiorparte dei casi modificazioni strutturali estese si osservano ben oltre le due ore dall’apprendimento (Maletic-Savatic et al 1999; Engert e Bonhoeffer 1999; ma si veda anche Sorra e Harris 1998). E’ poco probabile che lo stress abbia alterato l’eccitabilità della corteccia perché gli animali sono stati a lungo abituati al contatto con l’uomo, i controlli hanno subito lo stesso tipo di manipolazione prima del sacrificio ed infine lo stress comporta solitamente un aumento del LTD e una riduzione del LTP inducibili ( Xu et al 1997) e dunque non i cambiamenti osservati nel mio studio.
Lasciatemi aggiungere che la descrizione in vitro di una riduzione del gain sinaptico indotta dall’apprendimento esclude possibili effetti dell’attività muscolare e delle emozioni sull’eccitabilità neuronale come quelli descritti in vivo nell’ippocampo ( Moser 1995).
Il protocollo messo a punto potrà essere utilizzato anche per indagare i meccanismi molecolari intracellulari coinvolti nella memoria di riconoscimento. Un punto di partenza potrebbero essere i topi RasGRF1 KO. Questi mutanti non sono in grado di andare incontro a LTD da carbacolo e a LTP e hanno una memoria di riconoscimento a breve termine e dunque NMDA-indipendente, ma non riescono a consolidare le loro memorie. Una ritenzione del ricordo di un oggetto a 48 ore può essere ottenuta in questi animali solo mediante l’overtraining o l’arricchimento ambientale, un trattamento che aumenta l’espressione d’IGF-1 con conseguenze positive sull’azione delle neurotrofine in corteccia visiva (Ciucci et al 2007). L’induzione di LTD e LTP in corteccia peririnale provoca un rilascio