Un aumento del contenuto intracellulare di PCho può derivare da: (i) aumento del trasporto di Cho nella cellula e/o attivazione di colina chinasi (ChoK); (ii) attivazione di PtdCho-PLC in condizioni fisiologiche; (iii) incremento nella produzione intracellulare di Cho, conseguente all’attivazione di PLD o degli enzimi del pathway di deacilazione della PtdCho (PLA2, PLA1, lisofosfolipasi e GPCho-fosfodiesterasi (GPCho-PD) e successiva fosforilazione della Cho prodotta.
Trasporto della colina
Un aumento di Vmax del trasporto globale di Cho, associato ad incrementi significativi dei livelli di espressione di mRNA di due trasportatori, CHT1 (high affinity choline transporter-1) e OCT2 (organic transporter-2) è stato riportato da Eliyahu e collaboratori (35) in cellule umane di BC a confronto con cellule non tumorali di epitelio mammario (HMEC). Per quanto riguarda EOC, non abbiamo invece evidenziato differenze significative nei livelli di espressione globale di mRNA dei trasportatori di Cho (24).
Colina chinasi
La conversione ChoK-mediata della Cho in PCho rappresenta la prima, efficiente reazione del pathway di Kennedy nella biosintesi de novo della PtdCho. Nelle cellule di mammifero la ChoK comprende almeno tre isoforme, ChoKα1, ChoKα2 e ChoKβ (31). Le prime due isoforme derivano da splicing alternativo dello stesso gene (CHKA), mentre ChoKβ è il prodotto di un gene separato (CHKB). L’attività globale di ChoK dipende dalle percentuali relative di omo- ed eterodimeri formati da ChoKα e ChoKβ.
L’attivazione di ChoK, essenziale per l’induzione della sintesi di DNA da parte di mitogeni e fattori di crescita, è coinvolta nella carcinogenesi sia ras-dipendente che ras-indipendente (30) e nella progressione tumorale (36). L’attività di ChoK può essere indotta da effettori di Ras quali Ral-GDS e PI3K (31) e può essere regolata da HIF-1 (hypoxia inducible factor-1), la cui subunità alfa è capace di legare in vitro una regione di promoter del gene CHKA (37). D’altra parte, è riportato che l’attivazione di Chok e la conseguente produzione di PCho rappresentano eventi fondamentali nella fosforilazione di AKT (38) e nel signaling innescato da Raf-1 e MAPK (mitogen activated protein kinases) (39). È stato inoltre proposto che l’attività di ChoK e/o overespressione di ChoKα possano rappresentare fattori prognostici nel cancro della mammella (40), del polmone (41) e della vescica (42).
In linee stabilizzate di BC sono stati misurati aumenti di 2-5 volte nell’attività di ChoK rispetto a HMEC, associati ad incrementi di 5-8 volte nei livelli di espressione mRNA di
114
ChoKα (35). In linee di tumore ovarico, in collaborazione con la dott.ssa Silvana Canevari e collaboratori (Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, Milano) abbiamo riportato incrementi di attività enzimatica (12-25x), associati ad aumenti più limitati (3-4 x) nei livelli di mRNA ed espressione proteica di ChoK (Figura 2B) (24). Questo quadro suggerisce un forte ruolo dei meccanismi post-traslazionali mediati da oncogeni nell’attivazione di ChoK nel carcinoma dell’ovaio. Sostanziali aumenti di espressione di ChoKα sono stati rivelati anche in campioni chirurgici dissezionati da pazienti affette da EOC (Figura 2C).
Figura 2. Alterazioni del metabolismo della fosfatidilcolina in cellule di tumore ovarico
Nelle reazioni successive del pathway di Kennedy, i livelli di espressione dei geni responsabili dell’attivazione di CT (PCYT1A e PCYT1B) e PCT (CHPT1) in cellule EOC risultavano pari o anche inferiori a quelli misurati in cellule EONT (24), rafforzando il ruolo prevalente di ChoK nell’innalzamento del contenuto di PCho in cellule tumorali.
Fosfolipasi D
La PLD catalizza l’idrolisi della PtdCho in Cho e PA. Mentre la colina rientra come substrato nel pathway di Kennedy, il PA può agire come mitogeno, come precursore per la
115
produzione di DAG mediata da PA-fosfoidrolasi oppure come substrato di lisofosfolipasi per la generazione di lisofosfatidato (LPA), potente regolatore della crescita cellulare, specialmente nel carcinoma epiteliale dell’ovaio (43). L’attività della PLD è coinvolta in numerose funzioni della cellula, ivi comprese proliferazione, trasformazione da oncogeni, sopravvivenza e progressione tumorale (44). Tuttavia, una significativa attivazione di PLD è stata misurata in una sola di cinque linee di BC analizzate da Eliyahu e collaboratori (35) e in due su quattro linee di EOC esaminate dal nostro gruppo (24), suggerendo che questo enzima può contribuire solo occasionalmente al pool intracellulare di PCho in queste cellule.
Enzimi del pathway di deacilazione
La famiglia delle fosfolipasi PLA2 catalizza l’idrolisi di glicerofosfolipidi in lisofosfolipidi e acidi grassi liberi. Tra questi, l’acido arachidonico è precursore di eicosanoidi, la cui produzione esercita importanti funzioni fisiologiche e patologiche sia a livello di reazioni infiammatorie, che dei processi di apoptosi, angiogenesi, proliferazione cellulare e metastasi (45). Una minore espressione genica è stata tuttavia riportata per la PLA2 di gruppo IV in una linea cellulare di BC ad alta malignità (MDA-MB-231) a confronto con cellule HMEC (46). Analisi nel nostro laboratorio hanno mostrato una ridotta attività PLA2 in cellule EOC a confronto con EONT, in assenza di significative differenze nel livello globale di mRNA di 19 isoforme della famiglia (24).
Al termine del pathway di deacilazione della PtdCho, la GPCho-PD idrolizza la GPCho in glicerofosfato (GroP) e Cho libera, fornendo nuovo substrato per il pathway di Kennedy. In cellule EOC abbiamo misurato incrementi di attività di GPCho-PD di 2-4 volte soltanto in alcune delle linee EOC esaminate, a confronto con cellule EONT (24). Nel complesso, questi risultati mostrano che la via di deacilazione della PtdCho può contribuire solo in misura sporadica e limitata all’aumento di PCho in cellule EOC.
Fosfolipasi C specifica per PtdCho
Sebbene isoforme di PtdCho-PLC non siano ancora state sequenziate né clonate in cellule di mammifero, evidenze crescenti supportano il coinvolgimento di questo enzima in processi chiave nella biologia della cellula, quali attivazione del signaling recettoriale da parte di mitogeni, apoptosi, attivazione di cellule del sistema immune da parte di citochine e differenziamento di cellule staminali e tumorali (13, 15, 17, 18, 20, 27, 47, 48).
Incrementi di circa 3 volte nell’espressione proteica e di 5-17 volte nell’attività enzimatica di PCtdCho-PLC sono stati da noi riportati in cellule EOC a confronto con cellule EONT (Figura 2B) e in campioni chirurgici prelevati da paziente (Figura 2D) (24). Abbiamo altresì evidenziato aumenti di 3-6 volte nell’espressione proteica di PtdCho-PLC in cellule di tumore mammario appartenenti a sottotipi diversi (30). L’attività di questo enzima raggiungeva in cellule altamente maligne (quali MDA-MB-231) valori confrontabili a quelli riscontrati in cellule EOC.
L’esposizione per 24 h di cellule EOC ad un inibitore competitivo di PtdCho-PLC (triciclodecano-9-il-potassio xantato, D609) riduceva di circa il 40% l’area del segnale 1H MRS della PCho in cellule OVCAR3 e SKOV3.ip (24), fornendo la prima evidenza diretta di un sostanziale contributo dell’enzima al pool intracellulare di questo derivato della colina in un tumore epiteliale.
In conclusione, analizzando l’attività e i profili di espressione dei diversi enzimi coinvolti nel ciclo della PtdCho, abbiamo identificato ChoK e PtdCho-PLC come i principali responsabili dell’aumento di PCho nel profilo tCho di cellule EOC (Figura 2B).
116