L’esistenza delle CST implica nuove possibilità di sviluppare strategie terapeutiche mirate, con l’obiettivo di colpire il “cuore pulsante” del tumore. Lo sviluppo di terapie dirette contro le CST richiede l’impiego di adeguati modelli sperimentali in vivo e l’uso di tecnologie ad alta processività (high throughput) che forniscano una visione d’insieme delle pathway deregolate in questa popolazione cellulare. Nei laboratori dell’ISS sono in atto diverse strategie principali, descritte di seguito, mirate all’eliminazione delle CST di tumori solidi (Figura 2):
Figura 2. Workflow delle strategie di targeting delle cellule staminali tumorali
23
Identificazione di pathway-bersaglio nelle CSC e sperimentazione di farmaci mirati
Analisi genomiche globali effettuate su tessuti tumorali hanno dimostrato che le molteplici alterazioni genetiche presenti nei tumori sono riconducibili alla deregolazione di un numero limitato di pathway. In questo contesto, l’analisi proteomica rappresenta la tecnologia d’elezione per analizzare i circuiti di segnalazione aberranti nelle cellule tumorali. In particolare la proteomica a fase inversa (reverse phase protomic, RPP) permette la rapida identificazione di pathway attivate in campioni di entità limitata, come biopsie tumorali o cellule staminali. L’uso di RPP arrays viene applicato nei laboratori dell’ISS allo studio delle pathway attivate in CST di colon e glioblastoma e si basa su una piattaforma operativa di circa 300 anticorpi diretti contro forme totali o modificate (attraverso fosforilazione, taglio proteolitico, ecc.) di proteine cellulari implicate nelle principali pathway di proliferazione e sopravvivenza. I dati di RPP vengono correlati con i risultati di screening farmacologici effettuati sulle CST per studiare la corrispondenza tra stato di attivazione delle pathway e sensibilità a farmaci mirati. In questo modo sono stati selezionati dei farmaci innovativi (o delle combinazioni tra chemioterapici convenzionali e farmaci mirati) che sono attualmente in fase di sperimentazione preclinica su modelli in vivo di xenotrapianti tumorali ottenuti con CST. Infine, i profili di RPP ottenuti dalle CST vengono integrati con le informazioni cliniche per definire modelli molecolari di prognosi.
Processi di riparo del DNA come bersaglio terapeutico nelle cellule staminali tumorali
Il genoma di tutti gli organismi viventi è costantemente soggetto a condizioni che provocano danno al DNA. Per assicurare la trasmissione di una copia accurata del genoma da una generazione all’altra, le cellule posseggono una serie di vie di trasduzione del segnale denominate checkpoints del ciclo cellulare. Questi meccanismi di sorveglianza, in cui un ruolo predominante è svolto da ATM, ATR, Chk1 e p53, hanno il compito di trovare il DNA danneggiato e di coordinare la progressione del ciclo cellulare con la riparazione del DNA. Le CST sono resistenti agli agenti chemio- e radioterapici in virtù di un’iperattivazione delle pathway di riparo del DNA. In un studio pionieristico condotti in tumori cerebrali primari è stato dimostrato che CST di glioblastoma CD133+ attivano trasduttori di danno al DNA quali ATM e Chk1 più efficacemente rispetto alla controparte non tumorigenica CD133- (17). Una maggiore capacità di riparazione del DNA è stata descritta anche in CST di carcinoma mammario: l’analisi trascrizionale dei profili genici di cellule staminali tumorali mammarie derivanti da topi p53-null hanno indicato come queste cellule siano arricchite sia in geni coinvolti nel riparo del DNA sia nell’autorinnovamento (18). Nei laboratori dell’ISS è stato dimostrato che le CST derivate da carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) in seguito a trattamento con agenti chemioterapici si bloccano nella fase S e G2/M del ciclo cellulare per permettere il riparo del DNA, con conseguente sopravvivenza della cellula.
L’attivazione aberrante dei checkpoints G2/M nelle CST, ma non nella loro controparte differenziata, conferisce chemioresistenza alla popolazione staminale. Responsabile di questo processo è la proteina Chk1, che si attiva quando le CST vengono esposte ad agenti chemioterapici standard come cisplatino e taxani. A prova di ciò, l’inibizione farmacologica di Chk1 aumenta significativamente la chemiosensibilità innescando nelle CST polmonari una modalità di morte cellulare nota come catastrofe mitotica, volta ad eliminare cellule in stato di divisione cellulare aberrante (19). Lo studio approfondito dei meccanismi che regolano il danno al DNA nelle CST può essere sfruttato per aumentare l’efficacia degli attuali trattamenti antitumorali nel NSCLC e per il miglioramento della diagnosi di rischio.
24
Generazione di anticorpi monoclonali diretti verso le cellule staminali tumorali
I progressi compiuti negli ultimi decenni nella ricerca sugli anticorpi monoclonali (MAbs) in ambito oncologico hanno determinato un ampio utilizzo clinico di nuove strategie terapeutiche.
L’uso del bevacizumab (Avastin), un anticorpo diretto contro il VEGFR, in combinazione con un regime di chemioterapia standard ha significativamente prolungato l’aspettativa di vita dei pazienti metastatici con diversi tipi di tumori solidi. Allo stesso modo anche il cetuximab (Erbitux), diretto contro l’EGFR, ha mostrato una incoraggiante attività antitumorale in pazienti affetti da tumore al colon refrattario alla chemioterapia. Infine, il trastuzumab (Herceptin), anticorpo monoclonale diretto verso ErbB-2 associato a chemioterapia adiuvante, ha determinato una riduzione delle recidive e un aumento della sopravvivenza in pazienti ad alto rischio dopo asportazione chirurgica del tumore mammario. Lo sviluppo di nuovi MAbs diretti contro le CST potrebbe rappresentare una strategia terapeutica più efficace per l’ottenimento di una cura a lungo termine. All’ISS è stata messa a punto una metodologia basata sulla strategia degli ibridomi che permette la produzione di MAbs diretti contro le CST di glioblastoma, carcinoma polmonare e colon-rettale. I topi vengono immunizzati mediante inoculo intraperitoneale di CST e, dopo alcuni richiami (l’ultimo dei quali eseguito mediante somministrazione di sole membrane cellulari allo scopo di incrementare la risposta immune verso antigeni di superficie), gli splenociti vengono estratti e fatti fondere con una linea di mieloma. Gli ibridomi risultanti vengono testati per la reattività contro le cellule usate per l’immunizzazione, contro cellule mononucleate del sangue periferico per escludere gli ibridomi che abbiano un legame diretto contro antigeni umani ubiquitari e contro tutte le altre linee di CSCs disponibili. Alla fine del processo di selezione i migliori ibridomi vengono distinti tra quelli che riconoscono esclusivamente le cellule indifferenziate e quelli che riconoscono tutte le cellule tumorali. Gli anticorpi selettivi per le cellule indifferenziate possono avere utilità sia in diagnostica ma anche come potenziali agenti terapeutici contro le cellule staminali tumorali. Gli anticorpi positivi per entrambe le popolazioni di cellule (indifferenziate e differenziate) possono comunque avere un valore terapeutico in quanto hanno la capacità di colpire tutte le cellule tumorali. I MAbs con potenziale uso diagnostico vengono testati per un loro utilizzo in citofluorimetria, immunoistochimica, immunoprecipitazione e immunoblot al fine di ottimizzare la procedura di rilevamento. Infine si individua l’antigene contro il quale è diretto l’anticorpo monoclonale di interesse utilizzando la spettrometria di massa e si procede allo sviluppo e alla validazione di un protocollo diagnostico. Anticorpi che riconoscano nuovi antigeni di superficie delle CST possono essere utilizzati per l’isolamento e la caratterizzazione di queste cellule da biopsie di paziente, in particolare per il carcinoma del polmone e colon. Infine, gli anticorpi a più alta affinità e specificità potranno essere usati, sempre nell’ambito della diagnostica clinica, per il rilevamento di cellule tumorali circolanti. La scoperta di nuovi e specifici marcatori delle CST potrà dare un contributo fondamentale all’oncologia clinica sia dal punto di vista diagnostico che terapeutico.
Bibliografia
1. Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 1997;3(7):730-7.
2. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(7):3983-8.
3. Eramo A, Lotti F, Sette G, Pilozzi E, Biffoni M, Di Virgilio A, et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ 2008;15(3):504-14.
25
4. Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, Biffoni M, Todaro M, Peschle C, et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature 2007;445(7123):111-5.
5. Galli R, Binda E, Orfanelli U, Cipelletti B, Gritti A, De Vitis S, et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res 2004;64(19):7011-21.
6. Todaro M, Iovino F, Eterno V, Cammareri P, Gambara G, Espina V, et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res 2010;70(21):8874-85.
7. Zeuner A, De Maria R. Not so lonely at the top for cancer stem cells. Cell Stem Cell 2011;9(4):289-90.
8. Dieter SM, Ball CR, Hoffmann CM, Nowrouzi A, Herbst F, Zavidij O, et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell 2011;9(4):357-65.
9. Hoey T, Yen WC, Axelrod F, Basi J, Donigian L, Dylla S, et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell 2009;5(2):168-77.
10. Vermeulen L, De Sousa EMF, van der Heijden M, Cameron K, de Jong JH, Borovski T, et al.
Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nat Cell Biol 2010;12(5):468-76.
11. Todaro M, Alea MP, Di Stefano AB, Cammareri P, Vermeulen L, Iovino F, et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell 2007;1(4):389-402.
12. Diehn M, Cho RW, Lobo NA, Kalisky T, Dorie MJ, Kulp AN, et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature 2009;458(7239):780-3.
13. Cicalese A, Bonizzi G, Pasi CE, Faretta M, Ronzoni S, Giulini B, et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell 2009;138(6):1083-95.
14. Maugeri-Saccà M, Zeuner, A. and De Maria, R. Therapeutic Targeting of Cancer Stem Cells.
Frontiers in Oncology 2011;1(10):1-8.
15. Ricci-Vitiani L, Pallini R, Biffoni M, Todaro M, Invernici G, Cenci T, et al. Tumour vascularization via endothelial differentiation of glioblastoma stem-like cells. Nature 2010;468(7325):824-8.
16. Wang R, Chadalavada K, Wilshire J, Kowalik U, Hovinga KE, Geber A, et al. Glioblastoma stem-like cells give rise to tumour endothelium. Nature 2010;468(7325):829-33.
17. Bao S, Wu Q, McLendon RE, Hao Y, Shi Q, Hjelmeland AB, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 2006;444(7120):756-60.
18. Zhang M, Behbod F, Atkinson RL, Landis MD, Kittrell F, Edwards D, et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Res 2008;68(12):4674-82.
19. Bartucci M, Svensson S, Romania P, Dattilo R, Patrizii M, Signore M, Navarra S, Lotti F, Biffoni M, Pilozzi E, Duranti E , Martinelli S, Rinaldo C, Zeuner A, Maugeri-Saccà M, Eramo A, De Maria R. Therapeutic targeting of Chk1 in NSCLC stem cells during chemotherapy. Cell Death Differ 2012;19(5):768-78.
26