Meccanismo d’azione

Gli studi citati offrono una panoramica del complesso meccanismo d’azione dello xenon, al quale si attribuisce sì l’inibizione del recettore NMDA, evento che permette di indurre anestesia in modo diverso rispetto agli anestetici di routine, ma ciò che lo rende speciale è l’interazione con i fattori cellulari e di conseguenza l’influenza che esercita sull’espressione genica ed è anche su questo che si deve lavorare per comprendere i meccanismi che realizzano la protezione del SNC.

Si ricordi che per quanto inerte, lo xenon, così come gli altri gas nobili, forma dipoli temporanei che gli permettono di formare legami transitori con enzimi e recettori tramite forze di van der Waals,92 in particolare con le catene laterali di aminoacidi che compongono i siti attivi di alcune serino-proteasi (elastasi e collagenasi) nelle quali si forma una cavità specifica per legare un singolo atomo di xenon, senza indurre grandi cambiamenti nella struttura proteica. È stato dimostrato che lo xenon è in grado di legarsi nelle cavità dell’eme della citocromo P-450 monossigenasi ed è in grado di inibire l’attività catalitica di altri enzimi in vitro.93

Grazie all’elevato numero di elettroni la polarizzazione spontanea e transitoria è più facile da ottenere con lo xenon rispetto ad altri gas.

3.5.3.1 Trasmissione glutammatergica e danno eccitotossico

Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio del SNC dei mammiferi, ma in quantità eccessive può causare la morte della cellula. Viene prodotto per transaminazione dell’acido alfa-chetoglutarico, poi trasportato all’interno delle vescicole del terminale presinaptico dove, al momento della stimolazione, l’aumento del calcio intracellulare ne promuove l’esocitosi. Raggiunto il terminale postsinaptico, il glutammato lega i suoi recettori determinando l’ingresso di calcio e sodio e quindi la depolarizzazione della cellula e la trasmissione del segnale. A questo punto il glutammato viene rimosso dal vallo sinaptico dalle cellule gliali, nelle quali viene

92 _{Esencan E, Yuksel S, Tosun YB, Robinot A, Solaroglu I, Zhang JH, Xenon in medical area: emphasis}

on neuroprotection in hypoxia and anesthesia, op. citata

93

Preckel B, Weber NC, Sanders RD, Maze M, Schlack W, Molecular mechanisms transducing the anesthetic, analgesic, and organ-protective actions of xenon, op. citata

convertito a glutamina ad opera della glutamina sintetasi, forma che può diffondere nei neuroni dove viene di nuovo idrolizzata a glutammato.

Il potenziale di riposo è regolato dalle pompe di membrana, principalmente lo scambiatore Na/K, responsabile del mantenimento del gradiente del sodio e quindi del buon funzionamento del cotrasporto Na/glutammato che partecipa alla rimozione del neurotrasmettitore dal vallo sinaptico. L’azione sui recettori presinaptici, stimolati ad esempio dall’adenosina, inibisce il rilascio di glutammato.

I recettori ionotropici sono suddivisi in base all’affinità per il glutammato in recettori NMDA e non-NMDA, a loro volta distinti in AMPA e kainato.

Il recettore NMDA è formato da quattro subunità glicoproteiche, ciascuna costituita da quattro domini (M1-M4); i domini M2 di ciascuna subunità formano il poro del canale. Il legame del glutammato con il suo sito recettoriale induce il cambiamento conformazionale che apre il poro del canale. Tuttavia l’attivazione del recettore richiede altre due condizioni necessarie oltre all’interazione con il glutammato: il legame del coagonista glicina e la rimozione del blocco di magnesio.

Basse concentrazioni di glicina, come quelle presenti nel liquido extracellulare, sono sufficienti per aumentare la probabilità di apertura del recettore.

La rimozione del tappo di magnesio è voltaggio dipendente e richiede l’intervento dei recettori AMPA, presenti insieme agli NMDA sulla membrana postsinaptica. Gli AMPA legano il glutammato e grazie alla loro rapida attivazione determinano la depolarizzazione necessaria alla rimozione del tappo di magnesio, liberando il canale di NMDA, che a sua volta, in presenza di glicina e glutammato, permette il passaggio di cationi sodio e potassio, ma soprattutto l’ingresso di calcio nella cellula, all’interno della quale il reticolo endoplasmatico e i mitocondri agiscono da siti di deposito e regolazione del calcio intracellulare. La cinetica più lenta di NMDA permette la sommazione degli input che sta alla base della plasticità sinaptica, quindi dei fenomeni di apprendimento e memoria.

Durante l’applicazione prolungata del neurotrasmettitore, il recettore desensitizza, ovvero diventa refrattario pur mantenendo il legame con l’agonista. Mentre i recettori AMPA e kainato desensitizzano rapidamente, i recettori NMDA raggiungono il periodo refrattario più lentamente, che si traduce in un maggior tempo di apertura per il calcio.

L’altra faccia dell’interazione glutammato-NMDAR è l’eccitotossicità, termine coniato da Olney94 ad indicare il processo nel quale una eccessiva stimolazione da parte del glutammato sui suoi recettori, in particolare il tipo NMDA, determina un ingresso massivo di calcio nella cellula, causandone la morte per apoptosi. La disregolazione delle funzioni mitocondriali porta all’attivazione di proteasi, lipasi, endonucleasi, produzione di radicali liberi, sintesi di ossido nitrico e MAPK (mitogen-activated protein kinase) cui fa seguito la morte cellulare. Il danno a carico della membrana mitocondriale interna determina l’ossidazione delle proteine coinvolte nella sintesi di ATP, quindi le pompe di membrana si bloccano e la cellula va in apoptosi.

I meccanismi che collegano eccitotossicità e apoptosi sono ancora in parte oscuri, ma si ritiene che siano coinvolte due vie principali, controllate l’una dalla famiglia delle proteine Bcl-2/Bax e l’altra dalle cisteino-proteine o caspasi.95

L’aumento del calcio attiva la perossidazione lipidica e aumenta la produzione di monossido d’azoto (NO), radicale prodotto dalla nitrossido sintetasi endoteliale e neuronale. L’eccesso di NO causa disfunzione mitocondriale e dalla reazione con lo ione superossido (O2-) derivano i perossinitriti (ONOO-), che attaccano il DNA attraverso reazioni ossidative. L’aumento del calcio inoltre attiva la calpaina (che a sua volta attiva p38, kinasi proapoptotica), la kinasi p38 e JNKs e forma aggregati di proteine e acidi nucleici che deteriorano la membrana lipidica determinando la morte della cellula.96

I risultati ottenuti fino ad oggi dimostrano che sottoporre la cellula ad agenti lesivi multipli o comunque ad alta intensità produce necrosi, mentre se sottoposta a stimoli sub letali muore per apoptosi: il primo effetto si realizza a concentrazioni elevate e acute di glutammato, mentre concentrazioni più basse e diluite nel tempo attivano i meccanismi di morte programmata. Probabilmente uno stimolo subletale danneggia solo parzialmente i mitocondri, permettendo la produzione dell’ATP necessaria

94 _{Ma D, Wilhelm S, Maze M, Franks NP, Neuroprotective and neurotoxic properties of the “inert” gas,}

xenon, British Journal of Anaesthesia 89 (5): 739±46 (2002)

95

Conti Fiorenzo, Fisiologia medica, op. citata

96

Esencan E, Yuksel S, Tosun YB, Robinot A, Solaroglu I, Zhang JH, Xenon in medical area: emphasis on neuroprotection in hypoxia and anesthesia, op.citata

all’attivazione della cascata enzimatica dell’apoptosi, rilascio di citocromo c e attivazione di p38MAPK, c-Jun-N-terminale. Il danno secondario impiega ore per realizzarsi, aprendo una finestra di opportunità per le strategie neuroprotettive. I farmaci studiati fino ad ora sono tutti antagonisti del recettore NMDA: MK801, fenciclidina, ketamina. Tutti hanno dimostrato la loro efficacia in vivo e in vitro, tra cui anche la riduzione del deterioramento cognitivo dopo bypass cardiopolmonare. Tuttavia il loro impiego è stato abbandonato a causa degli effetti psicotici che producevano nell’uomo e delle disfunzioni motorie nei roditori. Si è visto che alle dosi somministrate (neuroprotettive) inducevano lesioni a carico dei neuroni corticali dei ratti nelle aree cingolata posteriore e retro splenica, le quali sono coinvolte nel comportamento. Sembra inoltre che la ketamina aumenti il metabolismo del glucosio, effetto da evitare in un’area ischemica. A questo si aggiunge il fatto che nessuno dei detti farmaci sia in grado di attraversare facilmente la barriera ematoencefalica, quindi servono dosi elevate che comportano maggiori effetti indesiderati.97

3.5.3.2 Inibizione recettoriale e modulazione dell’espressione genica

Le qualità di anestetico sicuro, cardioprotettore, neuroprotettore, renoprotettore, antinfiammatorio e molte altre suggeriscono che il meccanismo d’azione dello xenon non si limiti all’inibizione di NMDA, ma sottenda interazioni molto più complesse. Il comportamento dello xenon infatti si articola in due tempi:

 una fase precoce in cui agisce sul recettore NMDA riducendo l’eccitabilità cellulare

 una fase tardiva che interessa l’espressione genica responsabile degli effetti a lungo termine, la quale richiede più tempo per attivarsi ed è finalizzata a creare un fenotipo più resistente all’ipossia e alle condizioni ostili in cui si vengono a trovare le cellule sopravvissute al danno primario

97

Sun P, Gu J, Maze M, Ma D, Is Xenon a Future Neuroprotectant?, Future Neurology. 2009;14(4):483- 492

L’inibizione del recettore NMDA è di tipo non competitivo, poiché avviene mediante legame al sito della glicina, interagendo con l’anello aromatico di fenilalanina 758.98 Durante una lesione ischemica, come si può avere nell’ictus, i neuroni danneggiati depolarizzano, rilasciando glutammato in gran quantità nel vallo sinaptico, il quale stimola eccessivamente i recettori NMDA, alla cui apertura segue l’ingresso massivo di calcio nella terminazione postsinaptica e il danno si propaga rapidamente. L’obiettivo in questa fase è arrestare l’attivazione recettoriale evitando l’attivazione a cascata scatenata dal calcio.

Dal punto di vista clinico inibire NMDA determina vari effetti:

 anestesia: mentre gli alogenati inducono anestesia attraverso il potenziamento della trasmissione inibitoria GABAergica, lo xenon agisce sopprimendo la risposta eccitatoria, così come protossido d’azoto e ketamina;

 analgesia: la trasmissione dolorifica utilizza questo tipo di recettore;

 amnesia: NMDA è coinvolto nei processi di memoria;

 mancanza di euforia, evento comune sia al protossido che alla ketamina.

Fenciclidina e MK801 inibiscono il recettore NMDA legando un sito all’interno del canale quando questo è aperto, ma proprio questo meccanismo è alla base dei loro effetti allucinogeni, simili a quelle dei pazienti schizofrenici, suggerendo un ruolo di tali recettori alla base della malattia.99 In condizioni patologiche come l’ischemia, la concentrazione di glicina aumenta molto e con essa la stimolazione del recettore NMDA, evidenziando ancor più il ruolo dello xenon nel blocco della trasmissione eccitatoria.

Lo xenon si è rivelato capace di inibire i canali del potassio a due pori del tipo TREK-1, sul quale agisce con efficacia simile all’alotano, ma non TASK-3, sui quali l’alotano è invece efficace, coinvolti nella regolazione dell’eccitabilità cellulare, inducendo

98 _{Franks JJ, Horn JL, Janicki PK, Singh G, Halothane, isoflurane, xenon, and nitrous oxide inhibit}

calcium ATPase pump activity in rat brain synaptic plasma membranes, Anesthesiology. 1995 Jan;82(1):108-17

l’iperpolarizzazione della cellula che contribuisce all’effetto anestetico.100

Così come l’alotano, lo xenon interagisce con il C-terminale del canale TREK, tuttavia è più probabile che il primo sito di legame sia l’aminoacido Glu306, coinvolto nella regolazione del canale TREK da parte dell’acido arachidonico e importante per gli effetti dello xenon sul canale.101 TREK-1 è bersaglio anche del riluzolo, farmaco impiegato nella SLA.

Bantel e colleghi102 osservano l’apertura di canali K-ATP da parte dello xenon, ma non degli alogenati. Il canale K-ATP ricopre un ruolo molto importante nel precondizionamento, tuttavia è possibile proteggere i neuroni anche attraverso una via indipendente da tale canale, come fanno gli alogenati. Il problema dei farmaci che aprono i canali K-ATP è la difficoltà ad attraversare la BEE, ma le caratteristiche dello xenon permettono di superare questo ostacolo grazie alla rapida diffusione. L’evidenza del precondizionamento indotto da xenon permette di formulare ipotesi circa il suo impiego prima di procedure chirurgiche, principalmente a livello cardiovascolare, che sono frequentemente gravate da complicanze cerebrali come l’ictus. Si avanza anche l’ipotesi che lo xenon attivi i canali K-ATP sulle cellule muscolari lisce dei vasi e che ciò sia alla base dell’aumento del flusso ematico cerebrale, dovuto alla dilatazione dei vasi piali.

La conservazione dei neuroni si riflette in parte nell’attenuazione del declino cognitivo post-chirurgico in modelli animali. Ciò sembra correlare con la riduzione della reazione infiammatoria che coinvolge Hsp72 e PI3-kinasi. Il deficit di memoria indotto da chirurgia o isoflurano viene attenuato dal pretrattamento con xenon e ciò correla con la riduzione dei livelli plasmatici di IL-1β e uperegolazxione di Hsp72 nell’ippocampo.103

100 _{Franks JJ, Horn JL, Janicki PK, Singh G, Halothane, isoflurane, xenon, and nitrous oxide inhibit}

calcium ATPase pump activity in rat brain synaptic plasma membranes, op.citata

101 _{Preckel B, Weber NC, Sanders RD, Maze M, Schlack W, Molecular mechanisms transducing the}

anesthetic, analgesic, and organ-protective actions of xenon, op. citata

102 _{Bantel C, Maze M, Trapp S, Neuronal preconditioning by inhalational anesthetics: evidence for the}

role of plasmalemmal adenosine triphosphate-sensitive potassium channels, Anesthesiology. 2009 May;110(5):986-95

103

Vizcaychipi MP, Lloyd DG, Wan Y, Palazzo MG, Maze M, Ma D, Xenon pretreatment may prevent early memory decline after isoflurane anesthesia and surgery in mice, PLoS One. 2011;6(11):e26394

Un fattore cruciale nella sopravvivenza cellulare è il fattore inducibile dell’ipossia, HIF- 1α, la cui upregolazione è stata riscontrata in vari studi, sia a livello cerebrale104

sia renale.105 La potenziale applicazione del precondizionamento con xenon prima di procedure chirurgiche che richiedono ischemia renale merita di essere approfondita sul piano clinico, dal momento che permetterebbe di salvaguardare la funzione d’organo. HIF-1 è un etero dimero costituito da una subunità costitutivamente espressa, HIF-1β, e una subunità inducibile, HIF-1α, la quale presenta una breve emivita di circa 5 minuti ed è fortemente stimolata dall’ipossia. In realtà HIF-1α viene prodotta anche in condizioni di normossia, ma viene rapidamente degradata attraverso la via ubiquitina- proteasoma. In condizioni di ipossia il HIF-1α risulta stabilizzato e fosforilato dalle MAPK, dunque trasloca nel nucleo dove si lega a HIF-1β e forma un complesso trascrizionale che ha come target numerosi geni coinvolti nella sopravvivenza cellulare e che sono regolati in modo tessuto-specifico, al fine di realizzare l’adattamento ottimale. I geni target riguardano eritropoiesi, metabolismo del ferro, angiogenesi, metabolismo glucidico, sopravvivenza e apoptosi. In particolare risultano aumentati EPO e VEGF.106 L’upregolazione di HIF si realizza nell’ipossia, quindi anche nel precondizionamento ischemico, e sorprendentemente dopo esposizione a xenon, mentre non viene influenzato dagli alogenati, dunque non è correlato all’anestesia.

Lo xenon promuove la già citata cascata PKC-MAPK, che fosforila CREB (cAMP response element-binding protein) a pCREB, il quale forma un complesso con CBP (CREB binding-protein) in grado di attivare la trascrizione di fattori di sopravvivenza: BDNF (brain-derived neurotrophic factor) e Bcl-2.107

104

Limatola V, Ward P, Cattano D, Gu J, Giunta F, Maze M, Ma D, Xenon preconditioning confers neuroprotection regardless of gender in a mouse model of transient middle cerebral artery occlusion, op.citata

105 _{Ma D, Lim T, Xu J, Tang H, Wan Y, Zhao H, Hossain M, Maxwell PH, Maze M, Xenon}

preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alphaactivation, J Am Soc Nephrol. 2009 Apr;20(4):713-20

106 _{Ke Q, Costa M, Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1), Mol Pharmacol 70:1469–1480, 2006} 107

Weber NC, Toma O, Wolter JI, Obal D, Müllenheim J, Preckel B, Schlack W, The noble gas xenon induces pharmacological preconditioning in the rat heart in vivo via induction of PKC-epsilon and p38 MAPK, op. citata

Il calcio libero a basse concentrazioni è necessario alla cellula per svolgere le sue normali funzioni, per questo vi sono più meccanismi per mantenere l’omeostasi dello ione. Una parte rilevante assume la pompa del calcio ATP-dipendente (PMCA) presente sulla membrana plasmatica, la quale provvede a pompare il calcio fuori dalla cellula. Gli anestetici interferiscono con la trasmissione del calcio, producendo così l’effetto anestetico, in particolare lo xenon, come anche alotano, isoflurano e N2O, inibisce PMCA, mentre non agisce sulla pompa Na/K né sullo scambiatore di membrana Na/Ca.108 Nelle cellule endoteliali umane l’ATP determina un incremento di calcio a partire da due componenti: il rilascio intracellulare e l’ingresso dall’esterno. Cellule incubate con lo xenon mostrano solo il primo effetto, mentre non si evidenzia entrata di calcio dall’esterno; rimosso lo xenon, le cellule tornano a presentare entrambe le componenti.109

Nei ratti lo xenon stimola i neuroni noradrenergici più di quanto faccia il protossido d’azoto e questo può contribuire all’ipnosi e all’effetto simpatico. Nel cervello di ratto lo xenon aumenta inizialmente il rilascio di acetilcolina, seguito da una graduale riduzione in vivo. Inoltre lo xenon non ha effetti sull’acetilcolinesterasi in vitro. Tuttavia ancora non è chiaro il ruolo dello xenon sul sistema colinergico e di come questo incida su amnesia, analgesia, anestesia e organo protezione.110

Recentemente è stato osservato che lo xenon agisce su NMDA in modo più simile alla memantina, farmaco attivo sulla trasmissione del glutammato ed usato nella malattia di Alzheimer, che non a MK-801. L’affinità per questo recettore è bassa e non competitiva, con rapida associazione e dissociazione. I recettori nAch e NMDA contenenti la subunità NR2D hanno un tempo più lungo di inattivazione e un blocco più debole da parte del magnesio, a differenza delle subunità NR2A e NR2. Dunque il blocco indotto dallo xenon all’apertura del canale mediata da NR2D permette di svolgere il ruolo

108

Franks JJ, Horn JL, Janicki PK, Singh G, Halothane, isoflurane, xenon, and nitrous oxide inhibit calcium ATPase pump activity in rat brain synaptic plasma membranes, op.citata

109 _{Preckel B, Weber NC, Sanders RD, Maze M, Schlack W, Molecular mechanisms transducing the}

anesthetic, analgesic, and organ-protective actions of xenon, op. citata

110

Preckel B, Weber NC, Sanders RD, Maze M, Schlack W, Molecular mechanisms transducing the anesthetic, analgesic, and organ-protective actions of xenon, op. citata

neuroprotettivo riducendo l’ingresso di calcio. È importante osservare che la memantina non riduce il rilascio di LDH, cosa che invece fa lo xenon111

I recettori nAch nel SNC si trovano sul versante pre e postsinaptico, dove agiscono da modulatori del rilascio dei neurotrasmettitori. Si conoscono molte combinazioni di subunità ed è stato visto che isoflurano e propofol inibiscono il sottotipo prevalente (α4)2(β2)3 ma non hanno effetto su (α7)5, mentre l’alotano agisce su entrambi. Lo xenon inibisce (α4)2(β2)3 negli oociti di Xenopus, mentre α4β4 vengono solo lievemente interessati e le correnti prodotte da (α7)5 vengono inibite in modo reversibile e concentrazione dipendente, ma non competitivo e voltaggio-indipendente. Tuttavia, nonostante l’alta sensibilità di nAch agli anestetici, questi recettori non sono ritenuti indispensabili per l’anestesia. A concentrazioni cliniche rilevanti, lo xenon è in grado di inibire competitivamente il sottotipo 3A del recettore della 5-idrossitriptamina, indipendentemente dal potenziale di membrana, ma le conseguenze di questo effetto non sono note.112

Utilizzato in fase di precondizionamento, lo xenon mitiga l’apoptosi durante la sinaptogenesi in modelli animali, offrendo protezione a lungo termine grazie all’espressione di proteine come ADNP (activity-dependent neuroprotective protein), dalla quale dipende la sintesi di altre proteine in un tempo che va dalle 8 alle 24 ore dopo esposizione. Sembra inoltre che ADNP protegga dallo stress ossidativo indotto da H2O2, attraverso l’inibizione di p53 e in alcuni esperimenti si trova mRNA di ADNP dopo 29 giorni dal danno.113

In ambito cardiaco, Mio et al. espongono le loro osservazioni sulla permeabilità mitocondriale coinvolta nella morte cellulare. Oltre a ridurre le dimensione dell’infarto, lo xenon fosforila Akt e GSK-3β e inibisce l’ingresso di calcio nei mitocondri indotto

111

Sun P, Gu J, Maze M, Ma D, Is Xenon a Future Neuroprotectant?, op. citata

112 _{Preckel B, Weber NC, Sanders RD, Maze M, Schlack W, Molecular mechanisms transducing the}

anesthetic, analgesic, and organ-protective actions of xenon, op.citata

113

Cattano D, Valleggi S, Ma D, Kastsiuchenka O, Abramo A, Sun P, Cavazzana AO, Natale G, Maze M, Giunta F, Xenon induces transcription of ADNP in neonatal rat brain, Neurosci Lett. 2008 Aug 8;440(3):217-21

dall’apertura del poro di transizione, il quale è responsabile della depolarizzazione che scatena la cascata apoptotica in risposta al danno da ischemia-riperfusione.114

Infine un accenno agli ulteriori effetti di questo straordinario gas. Le proprietà analgesiche, molto utili in campo anestesiologico, sembrano derivare dall’effetto sui recettori NMDA delle corna posteriori a livello spinale, azione che non condivide con il protossido d’azoto. Questo è un aspetto che fa sperare nell’impiego come antidolorifico in pazienti pediatrici, ancor più in neonatologia, in quanto il miocardio del neonato è più sensibile alla depressione da parte degli anestetici volatili.115

Da quanto riportato da Ohara et al.116 l’azione non riguarda né i recettori degli oppioidi né gli adrenergici, utilizzate invece dal protossido, sembra piuttosto una soppressione diretta della trasmissione polisinaptica nelle corna posteriori. Diversamente dal protossido d’azoto, lo xenon non richiede il coinvolgimento del sistema inibitorio discendente, tuttavia non si esclude l’intervento delle strutture sovraspinali, poiché l’attivazione della sostanza reticolata con lo xenon indica l’attivazione di un sistema antinocicettivo sopraspinale.117

3.5.3.3 Vantaggi e svantaggi: cosa sappiamo degli effetti sull’uomo