Membrane A2P–TA–Sartoepoxy

A differenza delle A2P–Sartoepoxy, il ligando sintetico non è immobilizzato direttamente sulle membrane, ma viene usato un opportuno braccio spaziatore, indicato con la sigla TA (§ 2.3.3.3). Questa alternativa è stata proposta per risolvere i problemi legati ai supporti precedentemente esaminati, in particolare in termini di adsorbimento non specifico e recupero della proteina.

Diversi lotti delle membrane A2P–TA–Sartoepoxy sono stati ricevuti nel corso del progetto europeo AIMs in modo da verificare l’affidabilità e la ripetitività del protocollo di attivazione adoperato.

Prima di eseguire una caratterizzazione dinamica dei lotti ricevuti sono state condotte delle prove di equilibrio preliminari in condizioni batch. I risultati sono stati trattati secondo il modello di Langmuir ottenendo i parametri di equilibrio, riassunti per comodità in Tabella 3.8. Da una diretta osservazione dei risultati ottenuti si può stabilire che i diversi lotti non hanno le stesse caratteristiche; l’ultimo lotto ricevuto, SH 426, dovrebbe essere il prodotto di un’ottimizzazione del protocollo di attivazione delle membrane.

L’attenzione è stata focalizzata sulle membrane provenienti da due lotti: SH 211B perché mostrano caratteristiche di adsorbimento migliori rispetto le altre, e SH 426 perché relative al protocollo di attivazione ottimizzato. Anche le

membrane SH 265 ed SH 280 sono state studiate in condizioni dinamiche, ma i risultati ottenuti indicano una capacità di adsorbimento in forte diminuzione con il susseguirsi dei cicli cromatografici ed una resa di eluizione inferiore al 60% (dati non riportati).

Date le buone prestazioni mostrate in discontinuo dalle membrane SH 211B, lo studio sul questo lotto è stato condotto direttamente con il surnatante industriale, in cui la concentrazione di IgG umana è pari a 0.72 mg/ml. Sono stati eseguiti cinque cicli cromatografici consecutivi ad una portata fissa di 1 ml/min usando 5 membrane SH 211B sovrapposte. Le principali informazioni riguardo i cicli eseguiti sono riportati in Tabella 3.9.

Tabella 3.8: Parametri di equilibrio secondo il modello di Langmuir per i lotti di membrane A2P–TA–Sartoepoxy ricevuti.

Lotto SBCmax (mg/ml) Kd (mg/ml)

SH 211B 4.69 0.186

SH 265 2.91 0.103

SH 286 3.28 0.069

SH 426 3.24 0.055

SBC100% = capacità dinamica massima della membrana valutata in esperimenti batch.

Tabella 3.9: Tamponi usati e volume alimentato nelle fasi cromatografiche.

Fase cromatografica Tampone Valim (ml)

Equilibrazione PBS 0.1 M pH 7.4 20

Adsorbimento surnatante industriale 50

Lavaggio PBS 0.1 M pH 7.4 50

Eluizione acido acetico 0.1 M pH 2.7 10

Rigenerazione NaOH 0.6 M 20 Riequilibrazione PBS 0.1 M pH 7.4 10 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0 5 10 15 20 V (ml) cIg G ( m g /m l) 0 20 40 60 80 100 100 102 104 106 108 110 V (ml) A b s 2 8 0 n m ( m A U )

Figura 3.9: Curve di adsorbimento per il primo ciclo (


) ed il secondo

ciclo (



) in termini di

concentrazione di IgG. Lotto:

SH211B.

Figura 3.10: Curve di eluizione per il primo ciclo (linea continua) ed il secondo ciclo (linea tratteggiata) in termini di assorbanza a 280 nm. Lotto: SH 211B.

In Figura 3.9 sono riportate le curve di adsorbimento relativamente alla sola IgG per i primi due cicli eseguiti. Si ricorda che per la quantificazione dell’IgG nella miscela è necessario raccogliere dei campioni in uscita dal sistema ed analizzarli all’HPLC con colonna Proteina A (si veda § 2.4.1.3).

Le due curve di breakthrough si sovrappongono solo nella porzione iniziale, mentre nel tratto superiore si allontanano. È difficile stabilire se questa differenza sia dovuta alla presenza di siti di legame specifici e non specifici per l’IgG. Non si conosce infatti il comportamento dei contaminanti in miscela e le possibili interazioni che possono stabilire con il ligando immobilizzato. Per chiarire meglio questo dettaglio sarebbe necessario eseguire prove con soluzioni pure di IgG.

Ciò che si può affermare con certezza è che il secondo ciclo ha capacità di adsorbimento più bassa (DBC100% = 0.55 mg/ml) rispetto al primo (DBC100% = 0.67

mg/ml), con un calo tra i due cicli pari al 18%. In entrambi i casi la capacità è molto minore di quella teorica calcolata dall’isoterma di Langmuir alla concentrazione di IgG nell’alimentazione (DBCLangmuir = 1.31 mg/ml, calcolata dai

dati in Tabella 3.8). È probabile che il sistema sia poco selettivo e che le impurità presenti nel surnatante industriale siano in grado di bloccare alcuni siti di legame. Si ricorda a questo proposito che l’acido pluronico F68 contenuto nella miscela complessa interagisce fortemente con il ligando A2P (§ 2.3.2.2). È anche possibile che il protocollo di rigenerazione sia meno efficace quando si trattano miscele complesse piuttosto che soluzioni pure di IgG.

Il calo di capacità tra i due cicli è confermato qualitativamente anche dai profili di eluizione riportati in Figura 3.10. Difatti il picco di eluizione per il secondo ciclo è più basso rispetto al primo. Nonostante non si abbiano informazioni sulla composizione delle frazioni di eluizione, si può ragionevolmente supporre che in questa fase i contaminanti non siano predominanti sull’IgG, per cui il picco in termini di assorbanza è una stima qualitativa dell’IgG recuperato in eluizione.

Al fine di verificare l’effettiva ottimizzazione del protocollo di attivazione delle membrane, sull’ultimo lotto ricevuto, SH 426, sono stati eseguiti alcuni cicli cromatografici completi sia con soluzioni pure di IgG che con il surnatante industriale. In tutti i cicli sono state impiegate 5 membrane sovrapposte.

Nei primi esperimenti, una soluzione di IgG pura alla concentrazione di circa 0.81 mg/ml, è stata alimentata per quattro cicli consecutivi ad una portata di 2 ml/min. Le soluzioni usate nelle fasi di equilibrazione, lavaggio, eluizione e rigenerazione sono uguali a quelle usate per i cicli condotti con il lotto SH 211B e già riportate in Tabella 3.9.

I risultati sperimentali più significativi sono riportati in Figura 3.11 e Figura 3.12. Rispetto ai sistemi analizzati finora, questo lotto di membrane ha un comportamento più stabile con il numero dei cicli eseguiti. Basti dire che la

diminuzione della capacità tra un ciclo ed il successivo è in media inferiore al 5%. La capacità del primo ciclo è pari a 2.72 mg/ml, mentre per l’ultimo ciclo vale 2.43 mg/ml, valori di poco al di sotto della capacità teorica calcolata dall’isoterma di Langmuir alla concentrazione di 0.81 mg/ml (DBCLangmuir = 3.03 mg/ml, calcolata

dai dati in Tabella 3.8).

Tuttavia il recupero di proteina nella fase di eluizione è molto basso, e anche se con il numero dei cicli tende ad aumentare, la resa di eluizione media è del 56.5%, valore molto poco confortante.

I risultati dei cicli cromatografici condotti con il surnatante industriale non smentiscono il fatto che il protocollo di attivazione vada ulteriormente migliorato: la capacità della membrana è solo di 0.85 mg/ml, meno della metà di quella teorica (DBCLangmuir = 1.81 mg/ml). Inoltre il recupero in eluizione è solo del 4%, indice

della scarsa selettività di questo sistema nei confronti dell’IgG.

0 50 100 150 200 250 0 2 4 6 8 10 V (ml) a b s 2 8 0 n m ( m A U ) numero ciclo 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 2 3 4 numero ciclo m a s s a I g G ( m g )

Figura 3.11: Curve di adsorbimento per i quattro cicli eseguti. Lotto: SH 426.

Figura 3.12: Quantità di IgG adsorbita ( ) ed eluita ( ) nei quattro i cicli eseguiti. Lotto: SH 426.