DETERMINAZIONE DI ALFA ACIDI, BETA ACIDI E XANTOUMULONE (XAN): V-acidi, W- acidi e Xan sono quantificati, in singolo, tramite cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) secondo la metodica EBC (Analytica EBC, 1998). Per un corretto calcolo dei risultati è necessario conoscere il contenuto d’umidità dei campioni, in quanto i risultati sono espressi in percentuale peso/peso. Pertanto, per ogni campione, è stato determinato il contenuto d’umidità seguendo le linee guida riportate nei “Recommended Methods of Hop Analysis” (1964): 10 grammi di coni interi di luppolo sono posti in forno, preriscaldato a 103 °C ± 2°C, per un’ora esatta da quando la temperatura interna del forno si è ristabilita al valore di 103 gradi. I contenitori con i campioni sono quindi rimossi dal forno e richiusi con i rispettivi coperchi; dopo 15 minuti di raffreddamento a temperatura ambiente, si ripesano e la tara (contenitore più coperchio) si sottrae dal peso lordo del contenitore con il luppolo, dopo e prima l’essiccamento in forno. La sostanza secca (DMC) è calcolata come segue:
100 W1 W2
DMC= ×
Con: DMC esprime il contenuto di sostanza secca in percentuale (peso/peso); W2 è il peso del campione DOPO l’essiccamento in forno;
W1 è il peso del campione PRIMA dell’essiccamento in forno.
L’estrazione degli V-acidi, W- acidi e dello Xan è fatta agitando, per 40 minuti a 20 °C, 10 grammi di coni macinati di luppolo con 20 ml di metanolo, 100 ml di dietiletere e 40 ml di acido cloridrico 0,1 mol/l. 230 µl di supernatante sono posti in palloncini da 25 ml e portati a volume con metanolo. I campioni, filtrati con membrane a 0,45 µm nelle vials, sono stoccati al buio fino all’analisi. La soluzione standard è preparata giornalmente pesando, e portando a volume, 200 mg ± 10 mg di - e -acidi e 10 mg di Xan in 100 ml di metanolo. Da questa soluzione sono ricavate sette diluizioni in metanolo (da 1 a 7 ml in palloncini da 25 ml) per costruire la retta di calibrazione esterna. Gli eluenti impiegati nell’analisi HPLC consistono in 1700 ml di metanolo, 5 ml di acido fosforico e 300 ml di acqua con 75 mg di EDTA. Il flusso è settato a 1.5 ml/min ed il rivelatore a 325 µm. I risultati sono espressi in % (peso/peso) alla seconda cifra decimale.
DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE TOTALE (TAA) CON SAGGIO ABTS: è stata adattata la versione del metodo messo a punto per la prima volta da Miller et al. (1993), e poi ulteriormente modificato da altri autori (Re et al., 1999; Van den Berg et al., 1999; Cano et al., 2000). Questo saggio permette di determinare l’attività antiossidante totale di un campione avvalendosi della tecnica spettrofotometrica. Il metodo si basa sull’uso di una soluzione contenente una sostanza radicalica (ABTS°+), la cui assorbanza, a determinate lunghezze d'onda, diminuisce in maniera proporzionale alla quantità di composti antiossidanti aggiunti alla soluzione stessa. L'ABTS è una sostanza cromogena incolore che può essere convertita nella sua forma monocationica radicalica (ABTS°+) se trattata con un agente ossidante. La forma radicalica dell'ABTS è colorata e presenta diversi picchi di assorbimento, ben accentuati a 645, 734 e 815 nm. L'aggiunta di sostanze antiossidanti, capaci di donare un elettrone o un atomo di idrogeno, riduce l' ABTS°+, colorata, ad ABTS, incolore. Ciò determina una decolorazione della soluzione iniziale ed una diminuzione dell'assorbanza proporzionale alla quantità di antiossidante aggiunto. La percentuale di inibizione dell’assorbanza, misurata con lo spettrofotometro a 734 nm, entro una certa scala di tempo, è calcolata come funzione della concentrazione del campione nei confronti di uno standard di riferimento (nel caso specifico, acido ascorbico ). Pertanto l’attività antiossidante totale (TAA) di un campione è espressa in unità equivalenti di acido ascorbico e può essere definita come la concentrazione di acido ascorbico con attività equivalente ad 1 Zg/g di estratto di luppolo analizzato (si vedano formule sotto riportate).
100 % = × bianco A campione A bianco A Inibizione luppolo peso m estrazione vol diluizione Inibizione TAA × × × = % .
Con: % Inibizione: percentuale di inibizione dell’assorbanza, misurata a 734 nm, della soluzione contenente il radicale ABTS°+, dopo l’aggiunta del campione di cui si vuole misurare la capacità antiossidante;
A bianco: assorbanza del bianco di riferimento;
A campione: assorbanza del campione di cui si vuole misurare la capacità antiossidante;
TAA: attività antiossidante totale di un campione, espressa in unità equivalenti di acido ascorbico (Zg/g);
vol. estrazione: è il volume dell’estratto di luppolo, espresso in ml; m: è il coefficiente dell’equazione della curva di calibrazione;
peso luppolo: è il peso, in grammi, del campione di luppolo considerato.
La soluzione cromogena è preparata a partire da una soluzione tampone di acetato di sodio 50 mM, aggiustato a pH 5,4 con acido acetico glaciale 50 mM. Per evitare interferenze nelle letture spettrofotometriche, la soluzione tampone è sempre passata su filtri membrana 0,45 Zm prima di ogni altro utilizzo. Quindi 25 ml di AAPH 40 mM in soluzione tampone e 50 ml di ABTS 1,5 mM, in soluzione tampone, sono riuniti e portati a 500 ml con il tampone acetato. La soluzione così ottenuta, incolore, dopo essere stata incubata al buio per un’ora esatta a 55 °C, diviene di colore blu-verde ed è pronta per l’analisi spettrofotometrica. 3,125 ml di soluzione cromogena sono aggiunti a 25 Zl di standard, o di campione, esattamente 15 secondi dopo la miscelazione iniziale e fino a 14 minuti dopo la preparazione del relativo bianco (Fig. n. 26). Ogni misurazione è stata replicata tre volte. La curva di calibrazione è costruita con sei punti, adoperando acido L-ascorbico 0,5 – 1 – 1,5 – 2 – 2,5 e 3 mM.
Fig. 26: spettrofotometro con camera termostata utilizzato per il saggio ABTS. A sinistra le
cuvette, riempite con 3,125 ml di soluzione cromogena e 25 8l di campione o di “bianco”, sono pronte per la lettura spettrofotometrica. Lo spettrofotometro in dotazione consentiva la lettura di otto cuvette, ossia due campioni, per ogni ciclo di analisi: tre cuvette per ogni campione più una per il rispettivo bianco. A destra, è visualizzata, sullo schermo del computer, parte delle letture di assorbanza a 734 nm relative ad un campione.
DETERMINAZIONE DELLE (+)CATECHINE: L’estrazione delle catechine è stata fatta adattando il metodo di Forster (Forster et al., 2002). 3,5 grammi di luppolo macinato sono sottoposti ad agitazione per 30 minuti con 100 ml of acetone/acqua (75:25). Dopo essere filtrati, le sostanze non polari dei campioni sono rimosse con 30 ml di cloroformio. Il supernatante raccolto è portato a 50 ml con acqua, e ulteriormente diluito dieci volte prima dell’analisi
HPLC. Lo standard, preparato giornalmente, consiste in una soluzione metanolica di 1 g/l di (+)-catechina. La separazione cromatografica è condotta con un programma a gradiente. Le fasi mobili che sono impiegate sono una soluzione allo 0,05% di acido trifluoroacetico in acetonitrile (fase A) ed una soluzione acquosa allo 0,05% di acido trifluoroacetico (fase B). Il programma di eluizione è: da 10% A - 90% B a 20% A - 80% B nei primi 20 minuti con gradiente lineare; 80% A e 20% B dal minuto 20,1° al 25,0°; 10% A - 90% B dal 25,1° al 30,0° minuto. Alla fine di ogni corsa, è stato usato metanolo per pulire il sistema prima della successiva analisi. Le condizioni operative del sistema sono le seguenti: temperatura della colonna, 20 °C; flusso, 1 ml/min; volume d’iniezione, 30 ml; range di lunghezza d’onda, da 200 a 300 nm; larghezza della banda, 4 nm; intervallo dello spettro, 200 msec.
DETERMINAZIONE DELLE UNITA’DI AMARO E DEL CONTENTUO DI ALCOL: queste determinazioni sono effettuate solo sulle birre ottenute dalla sperimentazione pilota allestita a laboratorio, seguendo esattamente la metodica EBC (Analytica EBC, 1998). Il grado di amaro ottenuto è espresso come International Bitterness Unit (IBU), mentre il contenuto d’alcol è riportato in percentuale volume/volume di alcol (% v/v).
4.6 LIMITI E APPLICAZIONI DEI SAGGI PER LA DETERMINAZIONE DEL POTERE