Metodi analitici impiegati

A) N LATEX CDT

Principio del metodo:

è un dosaggio competitivo. La CDT presente nel siero del paziente compete, per il legame con anticorpi monoclonali anti-CDT adesi a particelle di polistirene, con la CDT adsorbita sulla superficie di altre particelle di polistirene miscelate con il campione in esame. In presenza di CDT nel campione si avrà una ridotta o assente aggregazione delle particelle di polistirene secondo il principio della competizione, mentre in assenza di CDT nel campione si avrà un’aggregazione delle particelle di polistirene. Ne consegue che ad elevate concentrazioni sieriche di CDT si avrà un basso segnale della luce di scattering e viceversa.

Composizione del kit:

- N CDT Reagent 1: sospensione di particelle di polistirene coattate con CDT < 0,017 g/L;

- N CDT Reagent 2: sospensione di particelle di polistirene coattate con anticorpo monoclonale anti-CDT (murino) <0,009 g/L;

- N CDT Reagente Supplementare: sospensione salina tamponata con fosfato con aggiunta di polyethylene glycol sorbitan monolaureate (5g/L) ed EDTA (<0,2mol/L);

- Standard SL N CDT: ad una matrice sierica umana è stata aggiunta CDT. La concentrazione di CDT è stata calibrata rispetto a CDT purificata.

- N CDT Human Control SL/1 e N CDT Human Control SL/2: matrice sierica umana stabilizzata con aggiunta di CDT purificata. La concentrazione di CDT è stata calibrata rispetto allo Standard SL N CDT.

Il test è totalmente automatizzato e per l'esecuzione abbiamo utilizzato come strumento il nefelometro BNII della Dade Behring sul quale vengono caricari secondo le indicazioni della ditta i campioni ed i reagenti su elencati.

Limitazioni per l'esecuzione del test e l'interpretazione dei risultati:

i campioni contenenti particelle devono essere centrifugati prima di essere analizzati. I campioni lipemici o contenenti particelle che non possono essere chiarificati mediante centrifugazione (10 minuti a circa 15 000 rpm) non devono essere utilizzati.

Non sono state segnalate interferenze per trigliceridi in concentrazione fino a 16,2 g/L, bilirubina fino a 0,6 g/L, emoglobina libera fino a 10 g/L e FR fino a 3.390 IU/mL. Non sono note interferenze con i farmaci più comuni.

I campioni dei pazienti potrebbero contenere anticorpi eterofili che potrebbero reagire nell'immunodosaggio e dare risultati falsamente elevati o ridotti. Questo sistema di analisi è stato studiato per ridurre al minimo l'interferenza dei suddetti anticorpi; tuttavia non è possibile garantire l'eliminazione completa di questa interferenza da tutti i campioni dei pazienti.

I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.

In virtù degli effetti matrice, i risultati ottenuti analizzando i campioni di controllo e i campioni di un sondaggio interlaboratori possono differire da quelli ottenuti con altri metodi. Pertanto, potrebbe essere necessario valutare questi risultati in base ai valori target specifici del metodo.

B) Test Bio-Rad %CDT TIA:

è un’analisi immunochimica eterogenea con separazione su colonna seguita da una misurazione nefelometrica.

la transferrina sierica viene saturata con ioni Fe 3+, successivamente la miscela campione-reagente viene fatta passare su colonna a scambio ionico. Le isoforme a basso contenuto in acido sialico (Asialo, Monosialo e Disialo) vengono separate e dosate successivamente con metodica nefelometrica applicata su analizzatore BNII (Dade Behring). Sia le isoforme separate che la transferrina totale sono dosate utilizzando il medesimo anticorpo anti-transferrina. Il risultato viene espresso come %CDT.

Limitazioni del metodo:

come già evidenziato nell'elenco di tutte le metodiche questo test immunometrico indiretto ha svariati punti negativi. Tra i principali: la scelta del momento di inizio e di fine della raccolta dell'eluato, l'influenza da parte delle varianti genetiche e dei fisiologici elevati livelli di trisialo-Tf, nonchè l'inclusione anche della forma monosialo- Tf con conseguente sovrastima del valore della CDT.

Per questi motivi tale tecnica è quasi totalmente abbandonata e non è più in commercio.

C) Metodo HPLC:

la scelta è ricaduta sul sistema cromatografico Agilent 1100 serie (Agilent Thecnology). Procedimento:

a temperatura ambiente vengono miscelati 100 µL di siero con 500 uL di Reagente Mix composto da: 500 µL di Bis-Tris Buffer, 10 µL di FeCl3, 10 µL di NaHCO3, 10µL di Dextran Sulfate, 10 µL di MgCl2.

Dopo incubazione sempre a temperatura ambiente per 30-60 min e successiva centrifugazione a 10.000 rpm per 10 min, 100 µL di sovranatante vengono iniettati su colonna. La separazione delle isoforme della transferrina si ottiene per gradiente di eluizione a 35°C, con una velocità di flusso di 1,3 mL/min, mentre la lettura viene effettuata a 460 nm UV/VIS. Un registratore/integratore è in grado di monitorare il segnale in uscita dal rivelatore UV/VIS. L’integrazione viene effettuata sulla linea di base e l’area di ogni isoforma rapportata alla percentuale dell’area totale della transferrina.

Riportiamo adesso due tracciati HPLC: il primo appartiene ad un campione con CDT negativa e il secondo ad un campione positivo.

Figura 6: esempio di tracciato HPLC di un campione con valore di CDT=1.0% quindi negativo.

Seguendo sull'asse delle ascisse il tempo in minuti della migrazione possiamo vedere come il picco della disialo-tf compaia a 3.83, quello della trisialo-Tf a 4.42, della tetrasialo-tf a 5.25 e la pentasialo appare per ultima a 5.95. Vediamo indicati i valori in percentuale delle singole glicoforme presenti, la cui somma corrisponde al 100% ed è la transferrina totale. Ovviamente il valore CDT corrisponde alla % della disialo-tf.

Area% DST=1.0 Area%DST=1.0

Area%TriST=9.5 Area%TetraST=79.2

Figura 7: esempio di tracciato HPLC di un campione con valore di CDT=6.7% quindi positivo. In

questo caso possiamo notare oltre all'elevato valore della disialo-tf anche la comparsa della forma asialo. Seguendo sull'asse delle ascisse il tempo in minuti della migrazione possiamo vedere come il picco della asialo compaia a 1.95, la disialo-tf a 3.78,la trisialo-Tf a 4.43, la tetrasialo-tf a 5.29 e la pentasialo appare per ultima a 5.99. Precisiamo che la componente asialo pur essendo presente non viene conteggiata nel referto ma che la CDT è sempre corrispondente solamente alla disialo-tf.

Limitazioni del metodo:

in caso di presenza di varianti della transferrina si ottengono tracciati particolari che pur

Area%AST=1.4 Area%DST=6.7

Area%TriST=5.8 Area%TetraST=73.4

non generando problemi interpretativi a livello di falsi positivi o falsi negativi in quanto riconoscibili appunto come varianti, per contro non possono essere refertati e quindi l'utente non potrà ricevere alcun risultato.