10. Scopo dello studio
10.3. Seconda parte dello studio
10.3.1.Casistica clinica
In questo secondo lavoro il numero dei campioni è inferiore. Da un lato abbiamo una popolazione di riferimento composta da 16 soggetti sani aventi un quadro clinico e biochimico non compatibili con una condizione di abuso alcolico cronico e dall'altro 19 soggetti che, per motivazioni medico legali diverse (sospensione patente di guida, affidi…), eseguono il dosaggio della CDT.
10.3.2.Metodi analitici impiegati
A) N LATEX CDT:
La composizione del kit il procedimento del test e le limitazioni del metodo sono invariati rispetto alla prima parte del lavoro.
B) Elettroforesi capillare zonale (CZE).
La scelta è ricaduta sul metodo multicapillare CAPILLARYS Sebia. Principio del metodo:
il metodo permette la separazione in tampone alcalino (pH 8.8) delle isoforme della transferrina sierica umana per elettroforesi capillare tramite il sistema automatico CAPILLARYS. Le isoforme della transferrina sono separate in cinque frazioni secondo
il loro grado di sialilazione: asialotransferrina, disialotransferrina, trisialotransferrina, tetrasialotransferrina e pentasialotransferrina. Il sistema permette di realizzare tutte le sequenze dell’elettroforesi fino all’ottenimento del tracciato elettroforetico della transferrina e del valore quantitativo della CDT. La lettura diretta fornisce automaticamente la percentuale di CDT calcolata rispetto alla quantità totale di transferrina rilevata.
Questa tecnica è come una separazione elettrocinetica effettuata in un capillare di silice fusa con un diametro interno inferiore a 100 μm riempito con un tampone composto da elettroliti. Per molti aspetti, questa metodologia puo essere considerata intermedia tra l’elettroforesi zonale classica su supporto solido e la cromatografia in fase liquida. Il sistema usa il principio dell’elettroforesi capillare in fase libera, che rappresenta la forma piu comune di elettroforesi capillare. Con questa tecnica le molecole cariche sono separate secondo la loro mobilita elettroforetica in un tampone alcalino a pH specifico. La separazione avviene in funzione del pH dell’elettrolita e del flusso elettro endo- osmotico. Abbiamo 8 capillari in parallelo, che permettono l’esecuzione di 7 test simultaneamente. Su questo sistema, l’iniezione del campione (diluito in un diluente specifico) nei capillari è effettuata all’anodo per aspirazione. La separazione è quindi realizzata applicando una differenza di potenziale di diverse migliaia di Volts alle estremita di ogni capillare. Le proteine sono rilevate direttamente per spettrofotometria di assorbimento a 200 nm all’estremità catodica del capillare. I capillari vengono quindi lavati con la soluzione di lavaggio e con il tampone di analisi. Con il tampone a pH alcalino, l’ordine di migrazione dellle transferrine è il seguente: asialotransferrina, disialotransferrina, trisilaotransferrina, tetrasialotransferrina e pentasialotransferrina. Composizione del kit:
- tampone a pH 8,8 ± 0,5 (acido borico, grezzo, naturale, contenente non più di 85 % di H3BO3 calcolato in base al peso secco 0,62%);
- diluente del campione (solfato di sodio e dodecile);
- soluzione di lavaggio alcalina a pH ≈ 12 (idrossido di sodio); - soluzione di lavaggio CDT;
- coppette multiple monouso per diluizione dei campioni da posizionare sul rack portacampioni;
- barrette lavaggio CDT monouso;
- filtri monouso per la filtrazione del tampone d’analisi, della soluzione di lavaggio ricostituita e dell’acqua distillata o deionizzata (utilizzata per il risciacquo dei capillari); - controllo normale CDT ottenuto a partire da un pool di campioni di siero umano normali;
- soluzione di trattamento dei campioni viscosi o torbidi.
Riportiamo adesso tre diversi tracciati elettroforetici: il primo è un campione negativo per CDT, il secondo fortemente positivo con la comparsa della forma asialo e l'ultimo è l'esempio di una variante. Nei tre tracciati sono indicate le percentuali delle singole frazioni.
Figura 11: in questo tracciato la CDT è 0,7% (negativa). Vediamo indicate le percentuali delle altre glicoforme della transferrina presenti.
15,4%
81,3%
2,6%
Figura 12: tracciato elettroforetico con CDT=13% (positivo). In questo caso vediamo la comparsa del picco della forma asialo (3,3%). Come abbiamo detto anch'essa è parte delle forme CDT correlate ma per convenzione refertiamo il valore prendendo in considerazione solamente la forma disialo per i motivi illustrati nella parte relativa all'importanza della standardizzazione dei risultati.
Figura 11: possiamo osservare in questo tracciato la presenza di una variante. In questo caso (non
sempre è possibile) abbiamo potuto avvalerci della funzione di calcolo della CDT e fornire un risultato = a 0,6%. Nel referto deve essere però indicato nelle note che il valore è stato calcolato.
12,8% 67,5% 3,4% 13% 3,3% Valore calcolato 0,6%
Limitazioni per l'esecuzione del test:
I seguenti fattori possono interferire con l'analisi: disordini congeniti della glicosilazione; casi di varianti genetiche della transferrina; proteine monoclonali o presenza di un fondo policlonale importante; fibrinogeno e campioni emolizzati; anticoagulanti (citrato, EDTA); campioni vecchi o conservati in cattive condizioni; epatopatie (gravi, stadio finale della malattia). Per i campioni con elevate quantità di crioglobuline o criogel che risultano torbidi e/o viscosi e mostrano tracciati elettroforetici con presenza di interfernze si può provare a trattare con la soluzione di trattamento del campone fornita nel kit.
10.3.3.Risultati
I risultati delle misurazioni della CDT sono riportati nelle due tabelle seguenti; la Tab. 6 è riferita ai 16 campioni di riferimento (soggetti sani), la Tab. 7 ai 19 campioni appartenenti a soggetti richiedenti il dosaggio per motivazioni medico-legali varie.
Numero campioni Capillarys N Latex CDT Confronto
1 0,4 1 N/N 2 0,8 1,8 N/N 3 0,6 1,2 N/N 4 0,6 1,3 N/N 5 0,7 1,3 N/N 6 0,7 1,6 N/N 7 0,8 1,2 N/N 8 0,6 1,1 N/N 9 0,7 1,5 N/N 10 0,5 1,5 N/N 11 0,7 1,7 N/N 12 0,8 1,6 N/N 13 0,9 1,7 N/N 14 1 1,6 N/N 15 1,1 1,9 N/N 16 1 1,7 N/N
N° campioni Capillarys N Latex CDT Confronto 1 6,1 6,3 P/P 2 14,1 9,6 P/P 3 3,6 4 P/P 4 1 1,9 N/N 5 2,9 2,9 P/P 6 1 1,8 N/N 7 2,4 2,8 P/P 8 1 1,8 N/N 9 4,1 3,9 P/P 10 0,9 1,8 N/N 11 2,8 2,9 P/P 12 0,9 1,4 N/N 13 1 1,5 N/N 14 0,9 1,9 N/N 15 2 2,3 P/N 16 6,9 7,6 P/P 17 1 1,5 N/N 18 3,7 3,7 P/P 19 5,9 4,2 P/P
Tabella 7: elenco risultati del campione composto da pazienti che richidevano il dosaggio per varie
ragioni medico-legali.
Nella popolazione di riferimento il valore medio ottenuto con CZE Capillarys è di 0,74 ± 0,19 e con N LATEX CDT di 1,48 ± 0,27.
Per quanto riguarda i valori di cut-off per CZE Capillarys i risultati possono essere classificati nella maniera seguente: CDT ≤ 1.3 %: risultato normale, CDT > 1.3 % e ≤ 1.6 %: risultato non conclusivo, CDT > 1.6 %: risultato patologico.
Per N Latex CDT in questo secondo lavoro abbiamo, in accordo con l'evoluzione continua della letteratura specializzata, aumentato il valore di cut- off dal precedente 2% all'attuale 2,5%.
La differenza media tra risultati, ottenuta con il test di wilcoxon ( 1,94%, p=0,05) non è statisticamente significativa.
I valori medi di CDT ottenuti nei 19 pazienti sono 3,27 ± 3,26 con Capillarys e 3,36 ± 2,25 con N LATEX CDT.
Il limite di quantificazione, definito come la più bassa concentrazione di CDT determinabile è 0,35% con Capillarys e 0,8% con N LATEX CDT.
CDT% CZE Capillarys N LATEX CDT
Valori medi
popolazione normale
0,74 ± 0,19 1,48 ± 0,27
Valori medi pazienti 3,27 ± 3,26 3,36 ± 2,25
Differenza media vs N LATEX CDT 1,94% 0 Cut-off 1,60% 2,50% Limite di sensibilità 0,35% 0,80% p=0,05
Tabella 8: confronto dei risultati nei due sets di campioni.
Abbiamo studiato il grado di correlazione fra i due metodi ottenendo una correlazione statisticamente significativa: r=0,96.
N LATEX CDT
CZE Capillarys Figura 12: correlazione tra CZE Capillarys e N LATEX CDT.
Utilizzando i valori di cut-off precedentemente descritti abbiamo classificato i campioni come positivi e/o negativi ottenendo i seguenti risultati: Capillars 11 positivi e 8 negativi; N LATEX 10 positivi e 9 negativi. Nello specifico il campione in questione ha
y=0,6633165139x+1,1864059386 r=0,96 R²=0,9242540593 n=19 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
dato con il metodo immunonefelometrico il valore 2,3% cioè prossimo al cut-off del metodo, inoltre possiamo ricordare che con il limite precendente uguale a 2% lo stesso campione sarebbe risultato negativo.
10.3.4.Valutazione dell'impatto organizzativo
Anche questo secondo confronto ha come obiettivo la valutazione delle ricadute sull'organizzazione della struttura laboratorio e gli indicatori considerati sono rimasti invariati e sono elencati nella tabella seguente:
Parametro CZE Capillarys N LATEX CDT
Personale dedicato No No
Strumento dedicato Si No
Costi complessivi Reagente Reagente
Tempo di esecuzione (25 test per seduta)
60 min 140 min
N° sedute settimanali 1 (da 1 a 6 secondo
esigenze)
Conservazione del campione Si No
Automazione Totale Totale
Controllo di tutte le fasi
analitiche Si Si
Qualità del dato analitico Quantitativo, Qualitativo Quantitativo Tabella 9: valutazione della ricaduta organizzativa.
10.3.5.Discussione
L' obiettivo finale come detto è valutare le performance analitiche del test immunonefelometrico, in comparazione adesso al metodo CZE Capillarys, nel diagnosticare la condizione clinica di abuso alcolico cronico e stimare i benefici, in termini di costi e di organizzazione derivanti dall’utilizzo in routine del metodo oggetto di studio.
delle performance delle due metodiche, sarebbe quindi interessante in futuro integrare lo studio con ulteriori misurazioni effettuate in parallelo. Tuttavia i risultati ottenuti, per il momento dimostrano che:
- il grado di correlazione tra i metodi è ottimale;
- la concordanza tra i risultati è buona con un solo risultato discordante.
Considerando tutti i parametri utilizzati nella valutazione organizzativa si nota immediatamente come le differenze tra le due metodiche siano minime e non risulti una netta spinta verso l'adozione di uno o dell'altro metodo. Abbiamo infatti per entrambi, una totale automazione, un controllo su tutte le fasi e l'assenza di personale dedicato. Analizzando le differenze apprezziamo come i minori tempi di esecuzione favoriscano la metodica CZE. L'unico punto da approfondire è il numero di sedute effettuabili; come vediamo per N LATEX non ci sono problemi infatti lo strumento non ha bisogno di particolari preparazioni ed i campioni con relativi controlli e reagenti possono essere caricati in qualsiasi momento. Per Capillarys non è così: quando si fanno le misurazioni della CDT, lo strumento deve essere impostato in esclusiva e ciò esclude la possibilità, nell'arco della sessione di effettuare qualsiasi altra attività. Inoltre ogni seduta implica l'utilizzo di sette test solo per il primo rack contenente il controllo, e questo fa notare come in caso di un basso numero di campioni la percentuale dei test utilizzati "a vuoto" sia proporzionalmente troppo elevata rispetto al totale delle misurazioni per seduta. D'altro canto è noto come la corretta conservazione dei campioni in congelatore non alteri il risultato e quindi, anche in situazioni nelle quali il numero giornaliero di campioni non è elevato, con adeguate misure conservative è accettabile concentrare le misurazioni in una unica seduta settimanale con il solo inconveniente dell'allungamento dei tempi di attesa per il paziente.
11.CONCLUSIONI
Siamo giunti alla fine di questa relazione nella quale è emerso come l'abuso alcolico sia un problema considerevole nella nostra società. Nell'arco degli anni sono stati cercati ed applicati strumenti per la diagnosi sempre più precoce del problema. Il dosaggio della transferrina carboidrato carente (CDT) è attualmente il biomarcatore migliore per l'individuazione dell' abuso alcolico e, nell'attesa che indicatori ancora migliori vengano scoperti, le nostre attenzioni da laboratoristi clinici sono tutte rivolte all'applicazione della metodica con il miglior rapporto tra performance analitiche e costi di gestione. In questo lavoro abbiamo confrontato il metodo immunonefelometrico diretto N LATEX CDT contro un metodo indiretto ed abbiamo chiaramente visto la superiorità analitica di N LATEX. Contro HPLC, metodo di riferimento ma più complesso a livello di gestione organizzativa, ha dato un buon grado di correlazione. Verso l'elettroforesi zonale capillare le discriminanti sono veramente ridotte tanto da non giustificare una scelta netta. Forse visto che il metodo in capillare fornisce un tracciato chiaramente interpretabile con indicate tutte le percentuali delle forme presenti, in un' ottica di confrontabilità dei dati tra laboratori e strutture diverse per una standardizzazione dei risultati sarebbe utile l'utilizzo di metodiche che forniscono chiaramente più informazioni utili paragonabili possibili.
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Ringraziamenti
...E finalmente anche la specializzazione è compiuta. Desidero fare un ringraziamento particolare al prof. Marco Mori per la cordialità e la disponibilità. Ringrazio poi il prof. Devoto, la dott.ssa Franca Deiana ed il dott. Iandolo per l'aiuto. Grazie a Michela. Grazie a tutto il laboratorio di Lavagna. E un grazie particolare a mia mamma e a Danilo il mio compagno di vita per l'importante sostegno.